专利名称：：一种固相合成阿托西班方法
技术领域：
：本发明涉及一种合成活性多肽原料药的方法，尤其是涉及一种固相合成阿托西班的方法。
背景技术：
：阿托西班(atosiban)，其化学名称为1_(3-硫醇丙醇酸)_2-(0_乙基_D酪氨酸)-4-L-苏氨酸-8-L-鸟氨酸-催产素。其结构式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>阿托西班是一种催产素类似物，为人工合成的环状多肽，是子宫内及蜕膜、胎膜上受体的催产素竞争性拮抗剂，在临床上使用其醋酸盐治疗早产。醋酸阿托西班注射液(AtosibanAcetateInjection)由辉凌公司(FerringAB)研制，2000年3月23日首次在奥地利上市，商品名为Tractocile。相关文献报道阿托西班的合成方法是通过Boc保护的甘氨酸(Gly)和氯甲基树脂制备得到氨基酸树脂，然后通过循环縮合偶联其余的保护氨基酸得到肽树脂，肽树脂经氨解后得到全保护肽，通过钠氢解脱去侧链保护基团，进行碘环化得到目的肽。该合成方法存在这样几个问题一、氨解低温操作要求且时间长，产品纯度不高，设备要求复杂；二、脱侧链保护基团用到金属钠，在安全性方面存在隐患，对生产操作有较大的限制；三、步骤较为繁琐，影响生产进度，增加了产品质量的风险。本发明结合肽的结构性质，选择了能直接用TFA裂解得到酰胺键的RinkAmide树脂作为起始树脂，选用了Fmoc固相合成方法解决了上述问题。
发明内容本发明的目的在于提供一种固相合成阿托西班的方法，以克服现有技术上存在的缺陷。本发明的方法包括以RinkAmide树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以DIPCI和H0Bt为縮合剂，依次逐个接上氨基酸，用碘进行固相环化，加入裂解试剂，用乙醚沉淀，获得氧化型粗品；采用反相高效液相色谱法进行分离纯化后，再经冷冻干燥获得游离肽或相应的盐。本发明的制备方法，步骤如下1)以Fmoc-RinkAmide树脂为起始原料，去除Fmoc后与Fmoc-Gly-0H的侧链羧基相连，得到Fmoc-Gly树脂；2)按照阿托西班氨基酸的结构顺序依次连接其余氨基酸；3)用碘进行固相环化；4)用裂解试剂进行切割得阿托西班粗肽，用乙醚沉淀粗肽；5)用反相高效液相法纯化分离。上述过程以H0BT、DIPCI为縮合试剂，以三氟乙酸/硫代苯甲醚/1，2_乙二硫醇/水为裂解试剂，树脂的取代值为0.60.8mmol/g。裂解试剂优选是按三氟乙酸硫代苯甲醚1，2-乙二硫醇水=90%:5%:3%:2%的体积比配制而成。用反相高效液相法纯化分离阿托西班时，其色谱条件优选为色谱柱4)15cm色谱柱填充剂十八烷基硅烷键合硅胶(C18)10iim上样量《50g目的肽/次检测波长230nm流速400ml/min流动相A:0.3%醋酸水溶液；B:乙腈色谱条件梯度程序见下表。时间(分钟)流动相A(%)流动相B(%)095510955106436705842705050745050本发明优选的制备方法，其步骤如下(1)制备Fmoc-Gly-树脂将RinkAmide树脂加入到反应柱中，加入DCM洗涤3次、再加入DMF洗涤3次，向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-Gly-OH及HOBT，加入N、N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶解，完全溶解后加入DIPCDI，搅拌均匀后加入到玻璃反应柱内，搅拌反应24小时。抽去反应液，用DMF/DCM/甲醇洗涤，抽干。(2)制备Fmoc-0rn(Boc)-Gly-树脂将Fmoc-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-0rn(Boc)-OH及H0BT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。(3)制备Fmoc-Pro-0rn(Boc)-Gly-树脂6将Fmoc-0rn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-Pro-OH及HOBT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。(4)制备Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂将Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH及H0BT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。(5)制备Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂将Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-Asn(Trt)-OH及H0BT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。(6)制备Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂将Fmoc-Asn(Trt)—Cys(Trt)—Pro—Orn(Boc)—Gly-树月旨力B入至U反应柱中，力口入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30X的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH及H0BT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。(7)制备Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂将Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂力B入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-Ile-OH及H0BT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。(8)制备Fmoc-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)_G1y-树脂:将Fmoc-Ile-Thr(tBu)—Asn(Trt)—Cys(Trt)—Pro—Orn(Boc)—Gly-树月旨力B入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-D-Tyr(Et)-OH及H0BT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。(9)制备Mpr(Trt)_D_Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂:将Fmoc-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树7脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30X的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Mpr(Trt)-OH及HOBT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。(10)环化称取碘(12)加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入到反应柱内，氮气吹搅反应30min。反应完毕后，抽去反应液，用DMF、DCM、甲醇洗涤，抽干。(11)裂解将环化后的树脂加入到圆底烧瓶中，加入配制好的裂解试剂(三氟乙酸硫代苯甲醚1，2-乙二硫醇水)，搅拌反应120min。过滤，树脂用三氟乙酸(TFA)洗涤。合并滤液，缓慢沉降到IO倍体积的无水乙醚中。静置2h后开始离心，离心完毕后用无水乙醚离心洗涤，即得氧化型阿托西班粗品。(12)纯化将得到的粗肽减压干燥后加水溶解，溶液用0.45iim的微孔滤膜过滤。滤液经C18柱分离纯化，以0.3%醋酸水溶液和乙腈为流动相，检测波长为230nm，流速300800m1/min，收集需要的流出液后，去盐，冷冻干燥，的目标产物，收率约为65%。本发明的的阿托西班制备工艺中，采用DMF、HOBT、和DIPCI进行縮合反应，具有操作简单，工艺稳定，副反应少，消旋率低的特点。裂解过程中采用TFA，而不是Boc策略的HF，大大降低了对人员的毒害及环境污染，并且未采用通常的离子交换柱换盐，而是将样品的纯化与换盐同时进行，减少了溶剂的浪费及目标产物的损失。生产成本低，产率高，在工业生产中具有重要意义。具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1制备Fmoc-Gly-树脂将100.OOgRinkAmide树脂加入到反应柱中，加入DCM550ml/次洗涤3次、再加入DMF550m1/次洗涤3次，向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF550m1/次洗涤6次，用5%的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-Gly-OH23.79g及H0BT10.80g，加入N、N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶解，完全溶解后加入12mlDIPCDI，搅拌均匀后加入到玻璃反应柱内，搅拌反应24小时。反应完毕后，抽去反应液，用DMF550m1/次洗涤3次，再用DCM550m1/次洗涤3次，最后用甲醇550ml/次洗涤3次，抽干，倒出，放入真空干燥箱干燥12h。取出称重，为103.19g，测定替代值为0.77mmol/g。实施例2制备Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂将103.19gFmoc-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM550m1/次洗涤3次、再加入DMF550m1/次洗涤3次。向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF550m1/次洗涤6次，用5%的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-Orn(Boc)-OH108.34g及HOBT32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF550ml/次洗涤6次，取样用5%的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。实施例3制备Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF550ml/次洗涤6次，用5%的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-Pro-OH及HOBT32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF550m1/次洗涤6次，取样用5%的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。实施例4制备Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF550ml/次洗涤6次，用5%的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH139.61g及HOBT32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1,1/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF550ml/次洗涤6次，取样用5%的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。实施例5制备Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF550ml/次洗涤6次，用5%的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-Asn(Trt)-OH142.23g及HOBT32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1,1/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF550ml/次洗涤6次，取样用5%的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。实施例6制备Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF550ml/次洗涤6次，用5%的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH139.61g及HOBT32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1,1/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF550ml/次洗涤6次，取样用5%的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。实施例7制备Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF550ml/次洗涤6次，用5%的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-Ile-0H84.24g及H0BT32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF550ml/次洗涤6次，取样用5%的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。实施例8制备Fmoc-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF550ml/次洗涤6次，用5%的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-D-Tyr(Et)-OH103.02g及HOBT32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF550ml/次洗涤6次，取样用5%的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。实施例9制备Mpr(Trt)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-0rn(Boc)-Gly-树月旨:向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF550ml/次洗涤6次，用5%的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Mpr(Trt)-0H83.06g及H0BT32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF550ml/次洗涤6次，取样用5%的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。实施例10环化称取31.73g碘(I2)加入1250mlDMF中搅拌溶解，完全溶解后加入到反应柱内，氮气吹搅反应30min。反应完毕后，抽去反应液，反应完毕后，抽去反应液，用DMF1250ml/次洗涤3次，再用DCM1250ml/次洗涤3次，最后用甲醇1250ml/次洗涤3次，抽干，倒出，放入真空干燥箱干燥12h。实施例11裂解将环化后的树脂加入到圆底烧瓶中，加入配制好的裂解试剂(三氟乙酸硫代苯甲醚1，2-乙二硫醇水=90%:5%:3%:2%)2200ml，搅拌反应120min。过滤，树脂用三氟乙酸(TFA)洗涤3次。合并滤液，缓慢沉降到22000ml的无水乙醚中。静置2h后开始离心，离心完毕后用无水乙醚2500ml/次离心洗涤6次，将得到的粗肽放入真空干燥箱内抽干，即得氧化型阿托西班粗品。实施例12纯化色谱柱4)15cm色谱柱填充剂十八烷基硅烷键合硅胶(C18)10m上样量《50g目的肽/次检测波长230nm流速400ml/min流动相A:0.3%醋酸水溶液；B:乙腈色谱条件梯度程序见下表。10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>将得到的粗肽减压干燥后加水35000ml溶解，溶液用0.45ym的微孔滤膜过滤。滤液按照纯化条件上样，收集流动相从0.3%醋酸水溶液乙腈(64:36)至0.3%醋酸水溶液乙腈(58:42)梯度内的目的峰溶液，并将收集的溶液浓縮，去盐，冷冻干燥，的目标产物，收率为66.5%。权利要求一种阿托西班的固相合成方法，其特征在于，该方法包括下列步骤1)以Fmoc-RinkAmide树脂为起始原料，去除Fmoc后与Fmoc-Gly-OH的侧链羧基相连，得到Fmoc-Gly树脂；2)按照阿托西班氨基酸的结构顺序依次连接其余氨基酸；3)用碘进行固相环化；4)用裂解试剂进行切割得阿托西班粗肽，用乙醚沉淀粗肽；5)用反相高效液相法纯化分离。2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，以H0BT、DIPCI为縮合试剂。3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，树脂的取代值为0.60.8mmol/g。4.根据权利要求l所述的合成方法，其特征在于，裂解试剂是按三氟乙酸硫代苯甲醚i，2-乙二硫醇水=90%:5%:3%:2%的体积比配制而成。5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，用反相高效液相法纯化分离阿托西班时，其色谱条件为色谱柱小15cm色谱柱填充剂十八烷基硅烷键合硅胶C1810上样量《50g目的肽/次检测波长230nm流速400ml/min流动相A:0.3%醋酸水溶液；B:乙腈色谱条件梯度程序见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤如下(1)制备Fmoc-Gly-树脂将RinkAmide树脂加入到反应柱中，加入DCM洗涤3次、再加入DMF洗涤3次，向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤，称取Fmoc-Gly-OH及H0BT，加入N、N_二甲基甲酰胺搅拌溶解，完全溶解后加入DIPCDI，搅拌均匀后加入到玻璃反应柱内，搅拌反应24小时，抽去反应液，用DMF/DCM/甲醇洗涤，抽干；(2)制备Fmoc-0rn(Boc)-Gly-树脂将Fmoc-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤，向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤，称取Fmoc-0rn(Boc)-OH及H0BT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min，抽去反应液，用DMF洗涤，(3)制备Fmoc-Pro-0rn(Boc)-Gly-树脂将Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤，向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤，称取Fmoc-Pro-OH及H0BT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min，抽去反应液，用DMF洗涤，(4)制备Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)_Gly_树脂将Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤，向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤，称取Fmoc-Cys(Trt)-OH及H0BT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min，抽去反应液，用DMF洗涤，(5)制备Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂将Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤，向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤，称取Fmoc-Asn(Trt)-OH及H0BT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入Immol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min，抽去反应液，用DMF洗涤，(6)制备Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂将Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤，向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤，称取Fmoc-Thr(tBu)-OH及H0BT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min，抽去反应液，用DMF洗涤，(7)制备Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂将Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤，向玻璃反应柱内加入配置好的30X的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤，称取Fmoc-Ile-OH及H0BT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min，抽去反应液，用DMF洗涤，(8)制备Fmoc-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂将Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树月旨加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤，向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤，称取Fmoc-D-Tyr(Et)-OH及H0BT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min，抽去反应液，用DMF洗涤，(9)制备Mpr(Trt)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-G1y-树脂:将Fmoc-D-Tyr(Et)-Ile—Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树月旨力口入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤，向玻璃反应柱内加入配置好的30%的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤，称取Mpr(Trt)-OH及H0BT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min，抽去反应液，用DMF洗涤，(10)环化称取碘加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入到反应柱内，氮气吹搅反应30min，反应完毕后，抽去反应液，用DMF、DCM、甲醇洗涤，抽干，(11)裂解将环化后的树脂加入到圆底烧瓶中，加入配制好的裂解试剂，三氟乙酸硫代苯甲醚1，2-乙二硫醇水，搅拌反应120min，过滤，树脂用三氟乙酸洗涤，合并滤液，缓慢沉降到10倍体积的无水乙醚中，静置2h后开始离心，离心完毕后用无水乙醚离心洗涤，即得氧化型阿托西班粗品，(12)纯化将得到的粗肽减压干燥后加水溶解，溶液用0.45m的微孔滤膜过滤，滤液经C18柱分离纯化，以0.3%醋酸水溶液和乙腈为流动相，检测波长为230nm，流速300800ml/min，收集需要的流出液后，去盐，冷冻干燥，得目标产物。全文摘要本发明涉及一种固相合成阿托西班方法，包括如下步骤1)以RinkAmide树脂为载体，脱Fmoc-保护后得到H2N-RinkAmide树脂；2)以HOBT、DIPCI为缩合试剂，将Fmoc-Gly-OH的羧基与树脂氨基相连，得到Fmoc-Gly(树脂)；3)采用Fmoc策略依次固相合成序列剩余氨基酸；4)用碘进行固相环化；5)然后用裂解试剂(三氟乙酸/硫代苯甲醚/1，2-乙二硫醇/水)切割，乙醚沉淀，得到阿托西班粗肽；6)粗品经HPLC制备分离得阿托西班纯品。文档编号C07K1/04GK101696236SQ200910008880公开日2010年4月21日申请日期2009年2月11日优先权日2009年2月11日发明者周宗贞,崔学云,杨平,蒋明更,马中刚申请人:海南中和药业有限公司;海南中和多肽药物研发有限公司;