专利名称：一个促进癌细胞凋亡的shRNA及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于分子遗传学领域，涉及一个能通过RNA干扰途径特异降 低细胞内^ferc-7基因表达量的发夹型小干扰RNA (命名为shHGRC-l) 的序列；以及利用这种发夹型小干扰RNA (shRNA)对餘2r-7基因进行 特异性干扰后引起细胞凋亡的作用，尤其是引起乳腺癌细胞系(MCF-7) 调亡的作用；本发明还涉及到该发夹型RNA在杀伤乳腺癌细胞、诱导癌 细胞凋亡方面的用途。
背景技术：
^^r-7基因是通过对某先天性静脉畸开肥大综合征(KTS)病例染 色体平衡易位点附近进行EST筛査时发现的一个新的非编码RNA基因， 在胎儿和成人的心、肝、脾等多种组织中均有持续广泛的表达。该基因 位于8号染色体长臂，全长873bp(见附图1)，经分析没有长的读码框， 是一个以RNA起作用的基因。该基因可能早期血管的发生与生成有关系， 可能会影响细胞的增殖与凋亡。
RNA干扰技术(RNA interference,简称RNAi)是通过小分子双链 RNA (dsRNA)特异性互补耙向基因转录本，从而诱导基因转录后沉默的 一种技术。人工合成或细胞内转录生成的小的双链RNA (siRNA)或者 发夹型RNA (shRNA)进入细胞后，能和与之互补的靶基因信使RNA结合， 从而介导特异性的切割酶将信使RNA降解，达到降低目的基因表达的目 的。RNA干扰的效应的关键在于耙基因序列的选取，不同位点的选取， 其效果差异很大。这种高度序列特异性使其能够专一特异地降低某一基 因的表达。己证实，RNA干扰可单独或与其他现有的治疗手段一同用于 疾病的治疗，如抗病毒感染、肿瘤治疗等。(参考文献(l)Andrew Fire, at al，Potent and specificgenetic interference by double—
strandedRNAin Cae/7ar/ aMz."51 e2e卵7 s, Nature 391, 806—811. (2) Carolyn Napoli, Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes // trans The Plant Cell, Vol. 2， 279-289，)
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进癌细胞凋亡的shRNA及其用途，该 shRNA能够促进癌细胞凋亡，本发明还提供了该shRNA的用途。
本发明提供的一种促进癌细胞凋亡的shRNA，其特征在于，其碱基序列 如SEQ ID No. 1所示，即5' -GGAUCAGACA GAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCU GAUCC -3。
该shRNA可以应用于抑制癌细胞增殖的药中。
本发明提供了一种可以特异性抑制人^ferc-7基因表达的发夹型干扰 RNA (shHGRC-l)。该发夹型干扰RNA具有以下序列5' -GGAUCAGACA GAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCU GAUCC _3' (SEQ ID No. 1)针对耙序列 是Hgrc-lRNA序列中为AAGGAUCAGACAGAGCCAAUG(SEQ ID No.2)的序列。本 发明还提供了编码该shRNA的DNA序列，以及包含该编码序列的质粒，利 用该质粒可以直接在细胞中，或者在体外生成shHGRC-l。本发明还证明了 该发夹型干扰RNA (shHGRC-1)在进入人乳腺癌细胞系中后，^ferc-7表达 量被降低，经流式细胞术PI单染检测细胞周期和细胞凋亡，并发现细胞凋 亡增加，细胞周期没有明显改变。这说明shHGRC-l在下调了乳腺癌细胞中 ^ferc-7基因的表达后，会癌细胞的凋亡，可以起到杀伤癌细胞的作用，具 有潜在的治疗癌症的价值。
附图1显示i^rc-7基因的基因组结构和差异剪接方式；
附图2显示通过RT-PCR验证人各种组织和不同细胞系中#5rc-7的表达，(a)为胃组织、脑组织和胃癌组织的表达，(b) MCF-7和HELA细胞 的表达，(c)主动脉、静脉和血细胞的表达，(d)胎儿心脏和肾脏等组 织的表达；
附图3显示RNA干扰质粒的构建；
附图4显示RNA干扰MCF-7细胞i^rc-7后其表达量(图中干扰质粒 子3为本发明中pGenesil-1- Hgrc-l质粒); 附图5对MCF-7细胞针对^ferc^基因进行RNA干扰后细胞凋亡情 况(图中干扰质粒子3为本发明中pGenesil-1- Hgrc-l质粒)。
具体实施例方式
vferc-7基因全长由华中科技大学人类基因组研究中心首先获得，该基 因的部分EST序列见Genebank中AI218163. 1， AI143880, 1， AI028191. 1， AI015296.1。
本发明提供的通过RNA干扰途径能特异性降低细胞内Hgrc-1量的发夹 型RNA ( shRNA )，具有如SEQ ID No. 1所示序列5 ' -GGAUCAGACA GAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCU GAUCC -3'。更具体地，它针对的耙序 列是^rc-7基因RNA序列中为AAGGAUCAGACAGAGCCAAUG(如SEQ ID No. 2) 的序列。
上述shRNA能通过下述二条DNA寡核苷酸链体外或体内转录生成 5' -GGATCAGACAGAGCCATGTTCAAGACGCATGGCTCTCTCTGATCC-3'(如SEQ ID No. 3)
5 ' -GGATCAGAGAGAGCCATGCGTCTTGAACATGGCTCTGTCTGATCC-3 ' (SEQ ID No. 4。该序列是SEQ ID No.3所述核苷酸序列的互补链序列。
包含上述SEQ ID No. 3和4所述DNA序列的质粒均能够在体内或者体 外通过转录生成如SEQ ID No. 1所述序列的RNA。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应说明，这些实施例仅 用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列事实例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实
验室手册(New York:Cold Spring harbor Ubortory Press, 1989), 分子克隆实验室指南(第三版，科学出版社，2002)中所述的条件， 或按照生产厂商所建议的条件。
实施例1
RT-PCR检测)^rc-J基因在人不同组织以及几种人源性细胞系中的表达
1、 RNA提取
用Trizol(Irwitrogene)分别提取六月龄人胎心脏、肝、脾、肺、肾、 小肠、卵巢、软骨、主动脉、脐静脉、视网膜组织，以及成人主动脉、成 人血细胞、成人静脉、成人脑组织、正常胃组织、胃癌组织的总RNA，具体 步骤如下，50 —l 00mg组织加lmlTrizol ，匀浆后室温放置lOmin ，加 入0 . 2ml氯仿/ lmlTrizol ，剧烈震荡15秒，取上层水相移入一新的 EP管，加入0. 5ml/lmlTrizol异丙醇，室温放置15min，然后4。C12000g 离心15min,去除上清后加lml75W用DEPC处理水配制的乙醇洗涤一次，然 后7500g离心10min，去除上清后空气中干燥30min，加30ulDEPC处理水 溶解，紫外分光光度计下OD260/280接近2.0，于-8(TC保存备用。人乳腺 癌细胞系(MCF-7)于DMEM高糖培养基(Invitrogen)，109()胎牛血清(Hyclone) 中铺板培养48小时后，6孔板每孔lmnVizol裂解细胞，其后步骤同上。
2、 逆转录
逆转录过程使用逆转录试剂盒进行(Promega)，具体如下取7ul步 骤1提取的RNA，加入lul Oligo d (T) 15， 5ulDEPC处理水，72。C保温10min 后置于冰上。然后加入4ul5 XM-MLV buffer, luldNTP (10mM)， 200L[M-MLV 逆转录酶，40URNA酶抑制剂，42。C保温60min。之后94。C变性10min，冰 上放置10min。
3、 PCR验证各个组织逆转录产物中Hgrc-l的表达
取步骤2中逆转录产物，稀释5倍作为PCR模版。以寡核苷酸D: 5' -GCGGATAATACAAGCCAAGTT -3'为正向引物，以寡核苷酸E: 5' -TGATGGATAATGTGCACTTGAGA -3'为反向引物，进行PCR反应。D/E PCR 反应的条件为94。C4min,随之94°C30秒，55°C30秒和72°C50秒进行
35个循环，最后72i:延伸7min，所得产物2%琼脂糖凝胶电泳。结果凝 胶成像系统拍照记录。结果见附图2。结果显示，在胎儿的心、肝、脾、 肺、肾、血管、视网膜、卵巢、软骨、脊髓等组织中有表达，在皮肤和
骨骼肌组织中表达量极低或不表达。在成人的动脉、静脉、血细胞、正 常胃组织、胃肿瘤组织中均有表达，在MCF-7和HELA细胞中也有表达。 (表l)
表1:胎儿和成人不同组织以及细胞系中Hgrc-l基因的表达
组织类型表达情况
胎心脏表达
胎视网膜表达
胎脾脏表达
胎肾脏表达
胎卵巢表达
胎软骨表达
胎血管表达
胎肺表达
胎脊髓表达
胎肝表达
胎皮肤不表达
胎骨骼肌不表达
成人动脉表达
成人静脉表达
成人胃组织表达
胃肿瘤组织表达
MCF-7细胞表达
HELA细胞表达
实施例2
降低Hgrc-l基因表达的RNA干扰靶点的选择、设计及合成 根据人Hgrc-l基因的mRNA序列，借助Ambion公司在网上提供的siRNA
工具软件选择下述靶点序列，并根据靶点序列设计相应的shRNA系列结构
及其编码序列。序列如下
靶点序列5'-AAGGAUCAGACAGAGCCAAUG-3' (SEQ ID No. 2)
shRNA序歹U: 5'-GGAUCAGACAGAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCUGAUCC-3'
(SEQ ID No. 1)
编码s國A的DNA序列为(SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4):
5' -GGATCAGACAGAGCCATGTTCAAGACGCATGGCTCTCTCTGATCC-3'和5' -GGATCAGAGAGAGCCATGCGTCTTGAACATGGCTCTGTCTGATCC-3。
根据以上序列，使用美国ABI公司392型DNA/RNA合成仪合成SEQ ID No. 1所示的RNA,以及SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的DNA，并且在两端 加上BamH I和Xma I的酶切位点，之后将合成的的SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4 DNA寡核苷酸链用水稀释到lOOmM，各取5ul混和，94'C变性5分钟后，于60 °。退火15分钟.然后将退火产物和空的pGenesil-1质粒(由武汉晶赛生物 工程有限公司提供)用BamH I和Xma I (NEB)进行双酶切，纯化酶切产物，各 取4ul用T4 DNA连接酶(NEB)连接，取连接产物涂LB培养基平板，抗生素为 卡那霉素,浓度为50ug/ml。 37t:培养14小时后挑取阳性克隆摇菌，提取质 粒，并测序验证。
实施例3
应用RNA干扰对乳腺癌细胞Hgrc-l基因表达进行特异性干扰
1.对人乳腺癌细胞(MCF-7) Hgrc-l进行RNA干扰
将能转录生成针对Hgrc-1的shRNA的pGenesil-l- Hgrc-1质粒转染 进入MCF-7细胞。具体步骤如下将MCF-7细胞铺板于6孔板中，密度为5 Xl()5个细胞每孔，培养基为DMEM高糖培养基(Invitrogen)，含10%胎牛 血清(Hyclone)， 100单位/ml氨苄青霉素，100mg/ml硫酸链霉素，37°C， 5%0)2条件下培养48小时后，去除培养基，用2ml无血清无抗生素的OPTI-MEM (Gibco)培养基同步化培养24小时。同一板上以一个孔只加 10ulLipofectamine2000作为空白对照， 一个孔以含有无关序列的 pGenesil-l质粒作为阴性对照。 一孔转染pGenesil-1-Hgrc-1质粒，另取 3孔转染3个也是针对Hgrc-l基因的干扰质粒作为对照(但已经证明这三 个干扰质粒没有干扰效果)。每孔4ug质粒DNA， 10ulLipofectamine2000 (Invitrogen)分别溶于250ulOPTI-MEM培养基中，并混合。保温20min 后将500ul混合物加入到每个孔中。干扰试验重复三次。
2. 干扰载体转录后干扰效果检测
pGenesil-l载体转染进入细胞后，可以表达生成绿色荧光蛋白 (EGFP)，在荧光显微镜下观察并计数有绿色荧光蛋白表达的细胞数， 以确定转染效率。经计数，转染效率约为70%。然后取各孔细胞提取RNA， 逆转录后RT-PCR检测Hgrc-l表达，并以管家基因0 -Actin作为内参比 较RNA干扰对降低Hgrc-1表达的效果。结果显示，转染特异性干扰质 粒的的MCF-7细胞Hgrc-1表达量相对空白对照和阴性对照明显减少， 其中pGenesil-l- Hgrc-l最为明显(附图4)。
3、 应用流式细胞术PI单染检测MCF-7细胞Hgrc-l基因RNA干扰后凋 亡情况
取如步骤1中转染了干扰质粒和对照质粒的MCF-7， PBS洗涤2次后， 75%冷乙醇固定24小时，然后PBS洗涤1次，加RNaseA (Sigma) 37。C消化 60min， RNaseA终浓度为50ug/ml。然后用碘化丙锭(PI)溶液(以PBS配 置)染色15min，之后用FACSORT流式细胞仪(BD biosciences)分析，激 发激光波长为488nm,分析PI荧光强度，结果用CELL QUEST软件分析获 得DNA量参数图像(如附图5)。结果表明转染干扰质粒的细胞凋亡比例 明显大于空白对照和阴性对照，pGenesil-1- Hgrc-1最为明显，凋亡率达 到37. 10%。这一结果表明shHGRC-1能有效降低细胞内餘/r-7的表达，并诱 导癌细胞凋亡，具有在抑制癌细胞增殖的药中的应用。序列表
<110〉华中科技大学
〈120> —个促进癌细胞凋亡的shRNA及其用途 <160〉 4
〈170〉 Patentln Version 3.1
〈210〉 1 〈211〉 45 <212>RNA
〈213〉智人(Homo Sapiens) 〈400〉 1
ggacagacag agccagcaag acgcaggccc cgacc
〈210〉 2 <211> 21 <212>RNA
〈213〉智人(Homo Sapiens) 〈400〉 2
aaggaucaga cagagccaau g
<210> 3 〈211> 45 〈212> DNA
<213>智人(Homo Sapiens) 〈400〉 3
ggatcagaca gagccatgtt caagacgcat ggctctctct gatcc
〈210〉 4 <211> 45<212>腿
<213〉智人(Homo Sapiens) <400> 4
ggatcagaga gagccatgc gtcttgaaca tggctctgtc tgatcc
权利要求
1、一种促进癌细胞凋亡的shRNA，其特征在于，其碱基序列如SEQ IDNo.1所示，即5’-GGAUCAGACA GAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCU GAUCC-3’。
2、 根据权利要求1所述shRNA，其特征在于其针对的耙序列如SEQ ID No. 2所示，B卩AAGGAUCAGACAGAGCCAAUG。
3、 根据权利要求1或2所述的shRNA，其特征在于该shRNA通过如 SEQ ID No. 3或4所示的DNA寡核苷酸链转录生成，即5 ' -GGATCAGACAGAGCCATGTTCAAGACGCATGGCTCTCTCTGATCC-3'，或5' -GGATCAGAG AGAGCCATGCGTCTTGAACATGGCTCTGTCTGATCC-3'。
4、 根据权利要求1或2所述的shRNA，其特征在于该shRNA通过包 含如SEQ ID No. 3或4所示的DNA寡核苷酸链的质粒转录生成。
5、 一种权利要求1所述的shRNA的用途，其特征在于该shRNA在抑 制癌细胞增殖的药中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种促进癌细胞凋亡的shRNA，其碱基序列为5’-GGAUCAGACAGAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCUGAUCC-3’。该shRNA针对的靶序列为AAGGAUCAGACAGAGCCAAUG。该shRNA通过下述DNA寡核苷酸链之一转录生成，5’-GGATCAGACAGAGCCATGTTCAAGACGCATGGCTCTCTCTGATCC-3’，或5’-GGATCAGAGAGAGCCATGCGTCTTGAACATGGCTCTGTCTGATCC-3’。这段shRNA能够通过RNA干扰途径(RNAi)，特异性降低人乳腺癌细胞系(MCF-7)中一个非编码RNA基因HGRC-1的表达，从而明显促进MCF-7细胞的凋亡。在用途上，该发卡型小RNA能用于诱导细胞凋亡，杀伤癌细胞，可以应用于抑制癌细胞增殖的药中。
文档编号C07H21/00GK101200482SQ20061012548
公开日2008年6月18日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者翔 任, 刘木根, 刘静宇, 徐承启, 铁 柯, 欣 涂, 擎 王 申请人:华中科技大学