一种生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系及其建立方法与流程

本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及一种可以生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系及其建立方法。技术背景自从1986年批准第一个抗体药物以来，抗体类药物已经过30多年的蓬勃发展，由于抗体药物具有高度的靶向性、特异性、专一性等明显优势，治疗领域也从传统的癌症、自身免疫性疾病逐步扩展到抗感染、代谢性疾病以及心血管疾病的诊治方面等，并取得了瞩目的疗效，在其改善患者生存质量的同时，也创造了巨大的经济效益。针对肿瘤的抗体除了阻断靶点介导的信号转导从而诱导细胞凋亡外，更多的治疗性抗体通过以下效应功能发挥治疗作用：细胞依赖的细胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，adcc)、细胞依赖的吞噬作用(antibody-dependentcellularphagocytosis，adcp)、补体依赖的细胞毒性作用(complement-dependentcytotoxicity，cdc)等。细胞依赖的细胞毒性作用(adcc)是指表达抗体fc受体(如fcγriiia)的自然杀伤细胞(nk)、巨噬细胞或中性粒细胞等，通过fc受体与已结合在靶细胞表面的igg抗体的fc段结合，进而活化，释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒物质直接杀伤靶细胞的作用。adcc是治疗性抗体临床疗效的关键机制之一，对于抗体发挥疗效至关重要，这一点也得到了临床研究的支持。抗体与fc受体(如fcγriiia)的结合情况直接影响抗体的adcc效应功能，可以通过改变抗体fc段的蛋白结构或是fc段的寡糖链修饰以增强抗体与fc受体(如fcγriiia)的结合能力，进而增强adcc效应，增强抗体临床治疗效果。增强治疗性抗体的效应功能不仅能够获得更好的治疗效果，同时可以减少治疗所需抗体用量从而降低治疗成本。近年来，研究发现去除或降低岩藻糖基化后，治疗性抗体在动物体内或临床表现出更好的疗效。主要是由于去除或降低岩藻糖基化的抗体提高与fcγriiia亲和力，可以在更低浓度下通过与fcγriiia的高亲和力而表现出较强的adcc作用，去除或降低岩藻糖基化成为提高下一代治疗性抗体效能的有效方法之一。因此，研究出能生产无岩藻糖基化抗体的工程细胞株是本领域的技术人员急待解决的问题。但目前大多数单克隆抗体都是由中国仓鼠卵巢细胞(cho)细胞制备的，这类抗体的核心岩藻糖基化水平很高，如何去除抗体fc区的核心岩藻糖提高其adcc效应是目前此类抗体研究的主要热点之一。其中，于2013年被批准上市的gazyva(obinutuzumab)，是获批上市的糖工程化单克隆抗体，其岩藻糖敲除是基于罗氏的glycomabtm技术平台，通过高表达β-1,4-n乙酰葡萄糖胺基-转移酶iii(gntiii酶)，促进n-糖末端平分型半乳糖苷的加入，进而抑制抗体核心岩藻糖修饰，进一步增强了抗体的adcc活性。但是该糖基化改造技术存在一定的缺陷：该技术通过引入平分型半乳糖苷，使得抗体上的糖型多达30种以上，其种类更多、更为复杂化，增加了糖型的异质性和产品的质量控制难度；此外该方法的岩藻糖去除效率低，仍有约30％的糖型含有核心岩藻糖。本申请通过对slc35c1和fut8两个基因同时敲除能够完全去除蛋白的岩藻糖基化，并且传30代次后仍无法检测到岩藻糖基化的蛋白，解决了岩藻糖基化去除不完全和传代不稳定的两大问题。技术实现要素：为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种可以完全去除蛋白岩藻糖基化的方法，所述方法是通过敲除slc35c1基因、和/或fut8基因来实现去除细胞生产出的蛋白岩藻糖基化的目的。根据上述方法，本发明还提供了一种可用于生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系，使用该基因工程细胞系可以制备无岩藻糖基化的蛋白。在本发明具体实施例中，使用该基因工程细胞系可以制备无岩藻糖基化的抗cd20的单克隆抗体。无岩藻糖基化的抗cd20的单克隆抗体与岩藻糖基化的抗cd20的单克隆抗体相比，具有增强的adcc效应。根据本发明的一个方面，本发明提供了一种生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系，所述基因工程细胞系是slc35c1基因沉默、和/或fut8基因沉默的细胞系。进一步，所述基因工程细胞系对以下至少一种凝集素具有抗性：小扁豆凝集素、豌豆凝集素、蚕豆凝集素、陈皮木耳凝集素。进一步，所述蛋白是含有fc区的蛋白。进一步，所述基因工程细胞系中含有编码含有fc区的蛋白的核苷酸序列。所述编码含有fc区的蛋白的核苷酸序列可以独立于所述基因工程细胞系的基因组存在，也可以整合到所述基因工程细胞系的基因组中。进一步，所述基因工程细胞系中含有cas9基因序列。所述cas9基因序列可以独立于所述基因工程细胞系的基因组存在，也可以整合到所述基因工程细胞系的基因组中。本发明的cas9包括但不限于spcas9、cas9-nickase(cas9n)、dcas9-foki等。在本发明的具体实施方式中，本发明采用的是spcas9。进一步，所述基因工程细胞系中含有针对slc35c1基因的sgrna的基因序列、和/或含有针对fut8基因的sgrna的基因序列。所述sgrna的基因序列可以独立于所述基因工程细胞系的基因组存在，也可以整合到所述基因工程细胞系的基因组中。根据本发明的另一个方面，本发明提供了前面所述的基因工程细胞系的建立方法，所述建立方法包括如下步骤：敲除宿主细胞中的slc35c1基因、和/或fut8基因，获得slc35c1基因沉默、和/或fut8基因沉默的细胞系。进一步，所述建立方法包括如下步骤：利用crispr/cas9技术敲除宿主细胞中的slc35c1基因、和/或fut8基因，获得slc35c1基因沉默、和/或fut8基因沉默的细胞系。再进一步，所述建立方法包括如下步骤：针对单独敲除slc35c1基因来说，(1)利用crispr/cas9技术，针对宿主细胞中的slc35c1基因设计sgrna序列，将其基因序列与cas9基因序列同时导入宿主细胞中；(2)抗性压力筛选获得生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系；针对单独敲除fut8基因来说，(1)利用crispr/cas9技术，针对宿主细胞中的fut8基因设计sgrna序列，将其基因序列与cas9基因序列同时导入宿主细胞中；(2)抗性压力筛选获得生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系；针对同时敲除slc35c1基因和fut8基因来说，(1)利用crispr/cas9技术，针对宿主细胞中的slc35c1基因和fut8基因分别设计sgrna序列，将其基因序列与cas9基因序列同时导入宿主细胞中；(2)抗性压力筛选获得生产无岩藻糖基化蛋白的稳定基因工程细胞系。上述建立方法中，将sgrna基因序列与cas9基因序列同时导入宿主细胞中的步骤可以包括：将sgrna基因序列与cas9基因序列分别连接到载体上构建敲除载体，将两个敲除载体同时转染进入宿主细胞中。作为可替代的方式，将sgrna基因序列与cas9基因序列同时导入宿主细胞中的步骤可以包括：将sgrna基因序列与cas9基因序列共同连接到一个载体上构建敲除载体，将构建的敲除载体转染进入宿主细胞中。在本发明的具体实施方案中，将sgrna基因序列与cas9基因序列同时导入宿主细胞中的步骤包括：将sgrna基因序列与cas9基因序列共同连接到一个载体上构建敲除载体，将构建的敲除载体转染进入宿主细胞中。根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种无岩藻糖基化的蛋白。所述蛋白是由前面所述的基因工程细胞系产生的。根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种前面所述的无岩藻糖基化的蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)根据前面所述的建立方法建立前面所述的基因工程细胞系；(2)将蛋白的编码序列导入步骤(1)获得的基因工程细胞系中，获得无岩藻糖基化的蛋白。根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的基因工程细胞系在制备无岩藻糖基化的蛋白中的应用。本发明的蛋白可以是重组蛋白，也可以是内源性蛋白。重组蛋白是将编码蛋白的核酸序列构建到表达载体中并将其导入宿主细胞以表达形成的外源蛋白。在具体的实施方式中，本发明的蛋白是重组蛋白。在具体的实施方式中，本发明的蛋白是含有fc的蛋白。本发明的含有fc的蛋白包括抗体、双特异性抗体、免疫粘附素和其它至少包含免疫球蛋白ch2和ch3区域的功能部分的结合蛋白。“功能部分”是指能够结合fc受体(例如fcγr或fcrn)的ch2和ch3区域，和/或能够参与补体激活的区域。如果ch2和ch3区域包含删除、置换、和/或插入或使其不能结合任何fc受体并且也不能激活补体的其它修饰，则该ch2和ch3区域不是功能性的。本发明的含有fc的蛋白还包括抗体衍生物，抗体衍生物包含抗体或包含抗体的fc结构域或fc区，通过共价结合异源分子进行修饰。抗体衍生物的例子包括结合结构域-ig融合体，其中所述结合结构域可以是，例如，配体、受体的胞外结构域、肽、非天然形成的肽，等等。免疫球蛋白或fc区的示范性融合体的例子包括：依那西普，其为stnfrii与fc区的融合蛋白(美国专利5,605,690)；阿来法塞，其为抗原呈递细胞上表达的lfa-3与fc区的融合蛋白(美国专利5,914,111)；细胞毒t淋巴细胞相关抗原-4(ctla-4)与fc区的融合蛋白(j.exp.med.181:1869(1995))；白介素15与fc区的融合蛋白(j.immunol.160:5742(1998))；因子vii与fc区的融合蛋白(proc.natl.acad.sci.usa98:12180(2001))；白介素10与fc区的融合蛋白(j.immunol.154:5590(1995))；白介素2与fc区的融合蛋白j.immunol.146:915(1991))；cd40与fc区的融合蛋白(surgery132:149(2002))；flt-3(fms-样酪氨酸激酶)与抗体fc区的融合蛋白(acta.haemato.95:218(1996))；ox40与抗体fc区的融合蛋白(j.leu.biol.72:522(2002))；以及与下述分子的融合蛋白：其他cd分子(例如，cd2，cd30(tnfrsf8)，cd95(fas)，cd106(vcam-i)，cd137)，粘附分子(例如，alcam(激活的白细胞粘附分子)，钙粘着蛋白，icam(胞内粘附分子)-1，icam-2，icam-3)细胞因子受体(例如，白介素-4r，白介素-5r，白介素-6r，白介素-9r，白介素-10r，白介素-12r，白介素-13rα1，白介素-13rα2，白介素-15r，白介素-21rα)，趋化因子，细胞死亡诱导信号分子(例如，b7-h1，dr6(死亡受体6)，pd-1(程序化死亡-1)，trailr1)，共刺激分子(例如，b7-1，b7-2，b7-h2，icos(可诱导共刺激物))，生长因子(例如，erbb2，erbb3，erbb4，hgfr)，分化诱导分子(例如，b7-h3)，活化因子(例如，nkg2d)，信号转移分子(例如，gpl30)，bcma，和taci。利用本发明的前面所述的基因工程细胞系可以制备出任何种类的无岩藻糖基化的抗体或抗体衍生物。利用本发明的前面所述的基因工程细胞系制备出的无岩藻糖基化的抗体或抗体衍生物的实例包括但不限于：抗her2单抗：曲妥珠单抗(trastuzumab，美国专利no5821337)、帕妥珠单抗(pertuzumab,美国专利no7862817)；抗egfr单抗：西妥昔单抗(cetuximab，美国专利no6217866)；抗cd20单抗：利妥昔单抗(rituximab，世界专利wo9411026)、obinutuzumab(中国专利授权公告号：cn1902231b)、ocrelizumab(中国专利公开号：cn101151278)；抗cd19单抗：轻重链cdr与hd37杂交瘤(pezzutto(1997),j.immunol.138,2793-9)相同的igg1嵌合抗体；抗cld18a2抗体：imab362(中国专利授权公告号：cn101687929)。在本发明的具体实施例中，利用本发明的前面所述的基因工程细胞系制备出的无岩藻糖基化的蛋白是无岩藻糖基化的抗cd20的抗体。抗cd20的抗体的重链蛋白序列如seqidno.1所示，编码重链蛋白的dna序列如seqidno.29；轻链蛋白序列如seqidno.2所示，编码轻链蛋白的dna序列如seqidno.30。利用本发明的基因工程细胞制备出的抗体包括但不限于鼠源抗体、人源化抗体、嵌和抗体、全人源抗体。优选地，本发明的基因工程细胞制备出的抗体是igg型单克隆抗体。利用本发明的基因工程细胞制备出的抗体可以是igg的不同亚型，包括igg1、igg2、igg3、igg4。按照本发明的方法制备的抗体和抗体衍生物可用于各种治疗或非治疗用途。例如，所述抗体可用作治疗抗体。抗体衍生物(例如，受体-fc融合体)可用作治疗分子。所述抗体或抗体衍生物可与其他分子偶联。所述抗体偶联于合适的药物(例如，抗体药物偶联物)或其他活性剂。所述抗体和抗体衍生物也可用于非治疗目的，如诊断试验、预后试验、释放试验，等等。按照本发明方法制备的抗体和抗体衍生物可被制成治疗用品或非治疗用品。所述抗体和衍生物可被制成药物组合物，其中包含治疗或预防有效量的抗体或衍生物以及一种或多种药学上相容的(可接受的)成分。例如，药物或非药物组合物通常包含一种或多种药物载体(例如无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。静脉内给予该药物组合物时，水是更常见的载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别适用于注射液。合适的赋形剂包括，例如，氨基酸、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物也可含有少量润湿剂或乳化剂或ph缓冲剂。这些组合物可采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、缓释制剂等形式。e.w.martin的《雷明顿药物科学》(remington'spharmaceuticalsciences)描述了合适药物载体的例子。这种组合物通常含有治疗有效量的蛋白质，通常为纯化形式，以及适量载体，以提供适合给予患者的形式。制剂对应于给药方式。静脉内给予的组合物通常是无菌等渗水性缓冲液配制的溶液。如果需要，药物也可含有增溶剂和局部麻醉剂，例如利多卡因来减轻注射部位的疼痛。通常，各成分单独提供或混合在一起以单位剂型的形式提供，例如在标明活性物质含量的密封容器如安瓿或药囊中的冻干粉末或无水浓缩物。通过输液给予该药物时，可用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶分配该药物。通过注射给予该药物时，可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便在给药前混合诸成分。本发明构建的前面所述的基因工程细胞系可以是瞬时转染/转导产生的细胞系，也可以是稳定转染/转导产生的细胞系。在具体实施例中，在本发明的所述基因工程细胞系是稳定细胞系。本文术语“稳定细胞系”是指细胞的性质可以稳定遗传，一般指的是稳定转染/转导产生的细胞系，即进入细胞的核苷酸序列整合到细胞的基因组上稳定遗传下去。本文术语“无岩藻糖基化”是指蛋白的糖基化修饰中不含岩藻糖基化。本文术语“核心岩藻糖”是指：在n-糖的核心五糖中，与天冬酰胺相连的glcnac上链接的岩藻糖。本文使用的术语“adcc”是指细胞介导的细胞毒性反应。本文使用的术语“增强adcc”是指在效应细胞存在下，与接触岩藻糖基化抗体的相同细胞的细胞杀伤相比，接触无岩藻糖基化抗体时，任何可测量的细胞裂解的增加，例如，细胞裂解增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或325％。本文使用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，它是指环形双链dna环，其中可以连接另外的dna片段。另一种载体类型是病毒载体，其中另外的dna片段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在它所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后可以整合到宿主细胞的基因组中，由此随宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够引导与它们有效连接的基因的表达。这些载体在本文中被称为“重组表达载体”(或者简称为“表达载体”)。通常在重组dna技术中使用的表达载体常常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明也包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们起等同的功能。本文术语“宿主细胞”包括适合于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括真核细胞(单细胞或多细胞)、酵母细胞(例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇型毕赤酵母等)、植物细胞、昆虫细胞(例如sf-9、sf-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(trichoplusiani)等)、非人类的动物细胞、人类细胞或细胞融合物，例如杂交瘤或四源杂交瘤(quadroma)。宿主细胞可以是人、猴子、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方式中，细胞是真核细胞并且选自下列细胞：cho(例如chok1、dxb-11cho、veggie-cho)，cos(例如cos-7)，叙利亚仓鼠，大鼠黑素瘤，小鼠黑素瘤(例如sp2/0、ns0)，视网膜细胞，vero，cv1，肾(例如hek293，293ebna，msr293，mdck，hak，bhk，bhk21)，hela，hepg2，wi38，mrc5，colo205，hb8065，hl-60，jurkat，daudi，a431(表皮的)，cv-1，u937，3t3，l细胞，c127细胞，mmt060562，sertoli细胞，brl3a细胞，ht1080细胞，人黑素瘤细胞，肿瘤细胞，人淋巴瘤细胞(例如namalwa细胞)和源自前述细胞的细胞系。在本发明的具体实施例中，宿主细胞选用的是cho。本文术语“抗体”表示：(1)免疫球蛋白多肽和免疫球蛋白多肽的免疫学活性部分，即免疫球蛋白家族的多肽或其部分，包含免疫特异性结合域特定抗原(例如，cd20)的抗原结合位点和包括复杂n-糖苷-连接糖链的fc结构域，或(b)这种免疫球蛋白多肽或免疫特异性结合抗原(例如，cd20)的片段的保守性取代衍生物。抗体的描述通常参见例如，harlow&lane，《抗体：实验室手册》(antibodies：alaboratorymanual)(冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，1988)。术语“双特异性抗体”包括能够选择性结合两个或两个以上表位的抗体。双特异性抗体一般包含2个不同的重链，每个重链特异性结合不同的表位-两个不同分子上的不同表位(例如两个不同抗原上的不同表位)或同一分子上的不同表位(例如，同一抗原上的不同表位)。如果双特异性抗体能够选择性结合两个不同表位(第一表位和第二表位)，则第一重链针对第一表位的亲和性一般比第一重链针对第二表位的亲和性低至少1至2或3或4或更多的数量级，反之亦可。由双特异性抗体特异性结合的表位可以在相同或不同的靶标上(例如在相同或不同的蛋白上)。可以通过例如组合识别同一抗原上的不同表位的重链来制备双特异性抗体。例如，可以将编码识别相同抗原上的不同表位的重链可变序列的核酸序列融合至编码相同或不同重链恒定区的核酸序列，可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达此类序列。典型的双特异性抗体具有2个重链，每个具有3个重链cdr，后跟(从n-末端至c-末端)ch1结构域、铰链区、ch2结构域和ch3结构域；还具有免疫球蛋白轻链，其不赋予表位结合特异性但是可以与每个重链结合，或者可以与每个重链结合并且可以结合重链表位结合区所结合的一个或多个表位，或者可以与每个重链结合并能使1个或2个重链与1个或2个表位结合。术语“单克隆抗体”指衍生自单个细胞克隆，包括任何真核或原核细胞克隆或噬菌体克隆的抗体。术语“fc区”表示抗体的恒定区，例如，ch1-绞链-ch2-ch3结构域，任选具有ch4结构域，或这种fc区的保守性取代的衍生物。术语“fc结构域”表示抗体的恒定区结构域，例如，ch1、绞链、ch2、ch3或ch4结构域，或这种fc结构域的保守性取代衍生物。本发明的有益效果：本发明利用crispr/cas9技术构建了slc35c1基因沉默、和/或fut8基因沉默的基因工程细胞系，该基因工程细胞系可以制备无岩藻糖基化的抗体，且细胞系的该性质可以长期稳定的遗传下去。附图说明图1质粒px330结构和插入位点示意图；图2显示不同细胞株表达的em201抗体n-糖型分析图；图3显示不同细胞株传代稳定性的n-糖型分析图；图4显示抗cd20的抗体与fcγriiia的结合活性检测图；图5显示抗cd20的抗体对daudi细胞的adcc效应图；图6显示抗cd20的抗体治疗对daudi细胞裸小鼠皮下移植瘤体积的影响图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1slc35c1基因敲除载体的构建靶向中国仓鼠slc35c1基因的mrna序列(nm_001246808.1，如seqidno.3所示)的编码区设计了4段grna(表1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，两条配对的单链(f和r)梯度退火后，与bbsi限制性内切酶消化的px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9(购买自addgene，货号plasmid42230；multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.congl,ranfa,coxd,lins,barrettor,habibn,hsupd,wux,jiangw,marraffinila,zhangf.science.2013jan3.10.1126/science.1231143pubmed23287718)载体连接。载体结构和插入位点示意图如图1所示。测序验证后确认获得了正确的克隆，转染top-10感受态细胞，挑取单克隆后摇瓶内培养，用无内毒素质粒大提试剂盒(天根生化科技北京有限公司)获得转染中国仓鼠细胞cho所用的质粒。表1靶向slc35c1基因的grna设计实施例2：fut8基因敲除载体的构建靶向中国仓鼠fut8基因的mrna序列(xm_003501735.2，如seqidno.14所示)的编码区设计了5段grna(表2)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，两条配对的单链(f和r)梯度退火后，与bbsi限制性内切酶消化的px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9(购买自addgene，货号plasmid42230；multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.congl,ranfa,coxd,lins,barrettor,habibn,hsupd,wux,jiangw,marraffinila,zhangf.science.2013jan3.10.1126/science.1231143pubmed23287718)载体连接。表2靶向fut8基因的grna设计测序验证后确认获得了正确的克隆，转染top-10感受态细胞，挑取单克隆后摇瓶内培养，用无内毒素质粒大提试剂盒(天根生化科技北京有限公司)获得转染中国仓鼠细胞cho所用的质粒。实施例3slc35c1基因敲除的cho细胞构建于125ml细胞培养摇瓶中接种30ml密度5×105的cho-k1(atcc)细胞，细胞活率在98％以上，细胞离心后，以电转缓冲液稀释至1×107cells/ml密度，将40μg构建好的靶向slc35c1基因的px330质粒加入电击杯中，再加入0.7ml细胞悬液，最后补入电转缓冲液至0.8ml，轻轻混匀，在300v，20ms的条件下电击一次，将电击杯置于冰盒中冰浴5min，转染后加入培养基，置于37℃、5％co2、转速130rpm的细胞培养摇床上培养。2天后，加入小扁豆凝集素lca(lensculinarisagglutinin)至200μg/ml，筛选稳定的抗性克隆；加药5天后，离心收集细胞，利用小扁豆凝集素lca对蛋白岩藻糖基的特异性亲和力，将共转染后的细胞使用biotin-lca标记、结合anti-biotinmicrobeads和macsld柱进行负性分选；分选后在300μg/ml的小扁豆凝集素lca培养24hr，有限稀释法将细胞接种到96孔板中进行细胞单克隆化，在300μg/ml的小扁豆凝集素lca克隆化培养，之后进一步接种到12孔或6孔直至转移至培养瓶中，获得单克隆细胞株。获得的单克隆细胞株抽提基因组dna后，pcr扩增slc35c1基因片段检测其中基因的突变情况，pcr正向引物序列为：5'-atgtgacaattgaaggctgtacc-3'(seqidno.12)；反向引物序列为：5'-agaaggaagtggtctgtttgag-3'(seqidno.13)。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，克隆到t载体pgm-simple-tfastvector(天根生化科技北京有限公司)，克隆后的载体用来测序，筛选出slc35c1基因阅读框都发生移码突变的单克隆细胞株，记作cho-k1-s-/-。实施例4fut8基因敲除的cho细胞构建于125ml细胞培养摇瓶中接种30ml密度5×105的cho-k1(atcc)细胞，细胞活率在98％以上，细胞离心后，以电转缓冲液稀释至1×107cells/ml密度，将40μg构建好的靶向fut8基因的px330质粒加入电击杯中，再加入0.7ml细胞悬液，最后补入电转缓冲液至0.8ml，轻轻混匀，在300v，20ms的条件下电击一次，将电击杯置于冰盒中冰浴5min，转染后加入培养基，置于37℃、5％co2、转速130rpm的细胞培养摇床上培养。2天后，加入小扁豆凝集素lca(lensculinarisagglutinin)至200μg/ml，筛选稳定的抗性克隆；加药5天后，离心收集细胞，利用小扁豆凝集素lca对蛋白岩藻糖基的特异性亲和力，将共转染后的细胞使用biotin-lca标记、结合anti-biotinmicrobeads和macsld柱进行负性分选；分选后在300μg/ml的小扁豆凝集素lca培养24hr，有限稀释法将细胞接种到96孔板中进行细胞单克隆化，在300μg/ml的小扁豆凝集素lca克隆化培养，之后进一步接种到12孔或6孔直至转移至培养瓶中，获得单克隆细胞株。获得的单克隆细胞株抽提基因组dna后，pcr扩增fut8基因片段检测其中基因的突变情况，pcr正向引物序列为：5'-gattccaggttcccatatattc-3'(seqidno.25)，反向引物序列为：5'-tgatgactgctagtgatgctac-3'(seqidno.26)，或正向引物序列为：5'-tgtctgaagcatcatgtgttg-3'(seqidno.27)，反向引物序列为：5'-acagtatttcatcaaatccttg-3'(seqidno.28)。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，克隆到t载体pgm-simple-tfastvector(天根生化科技北京有限公司)，克隆后的载体用来测序，筛选出fut8基因阅读框都发生移码突变的单克隆细胞株，记作cho-k1-f-/-。实施例5slc35c1和fut8基因双敲除的cho细胞构建将构建的敲除了slc35c1基因的稳定株cho-k1-s-/-细胞，按照实施例4敲除fut8基因，筛选出的克隆株即为slc35c1和fut8基因双敲除的cho细胞，记作cho-k1-sf-/-。实施例6抗cd20抗体的表达和纯化采用pcdna3.1作为骨架载体，将neomycin新霉素选择标签切除，替换为gs(谷氨酰胺合成酶，glutaminesynthetase)表达盒子，作为筛选标记；其中gscdna可以从表达gs的细胞系cho中通过rt-pcr获得，经改造后的载体命名为gs筛选载体。分别合成编码em201重链和轻链的dna序列(编码重链的dna序列如seqidno.29所示，编码轻链的dna序列如seqidno.30所示)，在轻链和重链间插入cmv启动子后，通过常规pcr在5’端引入hindiii酶切位点，在3’端引入noti酶切位点，插入到gs筛选载体的hindiii和noti之间，构建获得真核表达载体pem201。于125ml细胞培养摇瓶中接种30ml密度5×105的cho-k1、cho-k1-s-/-、cho-k1-f-/-和cho-k1-sf-/-细胞，细胞活率在98％以上，细胞以1×107cells/ml密度接种于电转缓冲液，将40μgpem201质粒加入电击杯中，再加入0.7ml细胞悬液，最后补入电转缓冲液至0.8ml，轻轻混匀，不要产生气泡。在300v，20ms的条件下电击一次，将电击杯置于冰盒中冰浴5min，稀释到6ml培养基中在37℃co2培养箱中恢复24h，向种子培养基中加入75μmmsx经过有限稀释法进行亚克隆筛选。通过有限稀释方法分单克隆细胞至96孔板内，37℃，5％co2培养箱培养，待细胞扩增至一定数量，进行elisa验证，挑选阳性克隆依次放大到24孔板、6孔板、t25方瓶。经过6～8周的培养及筛选，获得能够高效表达抗cd20抗体的单克隆细胞株。该抗cd20的抗体命名为em201，其重链和轻链的蛋白序列见seqidno.1和seqidno.2。单克隆细胞株经过培养基多步的扩大培养，接种密度为0.5×106cells/ml，加入msx至75μm，持续2周后，离心收集细胞于125ml摇瓶中培养，置于37℃、5％co2、转速130rpm的摇床上悬浮培养12天，期间在第3、6、9天以4g/l的终浓度补加葡萄糖，培养结束后收获上清，将上清进行纯化。采用akta(ge公司)进行em201抗体的分离纯化。首先收集过proteina亲和层析柱(mabselectsure)ph在3.4-3.6范围(用280nm进行监测)的洗脱液，调ph值至8.0，上样到阴离子交换层析柱(q-sepharoseff)，280nm进行监控和收集样品。将收集液ph值调节至5.5，上样到阳离子交换层析柱(poros)收集样品,超滤浓缩后获得抗cd20的抗体。实施例7抗cd20抗体(em201)的糖型分析取200μg抗cd20抗体，超滤管除盐后加入10μlg7酶切缓冲液、1μlpngasef、加水至100μl，于37℃恒温10hr。将酶切好的样品加入300μl的-20℃乙醇混匀，静置20min后12000rpm离心3min，取上清真空浓缩干燥，得到n-糖干粉。dmso和乙酸按照350μl:150μl比例混匀，取5mg2-ab、6mgsodiumcyanoborohydride溶于100μl的dmso和乙酸混合液中，取混合液10μl加入真空浓缩的n-糖干粉中，65℃衍生3小时，加入80％的乙腈和水混合液200μl，离心2mins，取上清，液相分析：色谱柱：watersacquityuplcbehamide1.7μm；柱温：40℃；激发波长：λex＝330nm；λem＝420nm；进样量：10μl；液相梯度如表3所示。表3梯度洗脱时间表时间(min)流动a％(甲酸铵)流动相b％(乙腈)02080202080252575754060806535856535862080962080抗cd20的抗体em201分别由cho-k1、cho-k1-f-/-、cho-k1-s-/-和cho-k1-sf-/-细胞表达，其糖型图谱如图2所示，由图2以及下面的表4可见，与cho-k1细胞株表达的em201相比，cho-k1-f-/-、cho-k1-s-/-细胞表达的抗体岩藻糖的含量显著降低，仅有0.6％和1.8％的糖型含有岩藻糖；而cho-k1-sf-/-细胞表达的抗体未检出含有岩藻糖的糖型，表明与单独敲除slc35c1和fut8基因相比，双基因敲除去除岩藻糖更为完全。表4不同细胞株表达的em201抗体n-糖型比例图例：n-乙酰氨基葡萄糖：■；岩藻糖：；甘露糖和半乳糖：●实施例8岩藻糖敲除稳定株的传代稳定性为满足蛋白药物产业化生产规模对传代和细胞倍增水平的要求，对构建的稳定细胞株进行传代稳定性研究。从细胞库开始传代至30代，涵盖了拟定的产业化生产规模对传代和细胞倍增水平的要求，并在此基础上增加15代以保证稳定性研究对未来生产规模要求的覆盖性。细胞每2-4天传一次，共30代次，通过调查细胞在不同阶段的倍增时间、倍增水平、最大细胞密度、生产能力、抗体比生成速率，以及评估抗体表达量和质量，对细胞的传代稳定性进行分析。细胞株传代稳定性结果显示，细胞传代至p30，细胞密度、细胞倍增时间、活率、抗体比生成速率、抗体表达量及抗体质量基本稳定，符合作为工程细胞株的要求。但是cho-k1-s-/-和cho-k1-f-/-细胞株随着传代次数的增多，岩藻糖糖型的比例显著增加(图3和表5)，分别增至1.7％和4.7％，可能是由于其它糖基化的旁路被激活所致；而双基因敲除的cho-k1-fs-/-细胞株传代至30代，仍无含有岩藻糖的糖型检出(图4和表5)。表明与单独敲除slc35c1和fut8基因相比，双基因敲除的细胞株其cho-k1-fs-/-传代稳定性更好，且核心岩藻糖敲除更彻底，优选的作为岩藻糖彻底敲除的细胞株进行应用开发。表5不同细胞株传代稳定性的n-糖型比例图例：n-乙酰氨基葡萄糖：■；岩藻糖：；甘露糖和半乳糖：●实施例9抗cd20抗体与fcγriiia结合活性分析anti-his(r&d公司)抗体用ph9.6的碳酸盐缓冲液将稀释至1μg/ml，加入酶标板中4℃孵育过夜。洗板并封闭后(含5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液)，加入1μg/ml的fcγriiia(158v)(r&d公司)，37℃孵育1h。将待测样品：em201(cho-k1-fs-/-表达)、em201(cho-k1表达)、gazyva(genentech公司)分别与anti-humanκ(r&d公司)以1:2的比例混匀，37℃孵育1h后将抗体稀释到50μg/ml，再进行3倍的梯度稀释获得10个浓度点。酶标板加入稀释后的抗体和anti-humanκ的混合液100μl，37℃孵育1小时。洗板后将hrp偶联的goatf(ab′)2anti-humaniggf(ab′)2(r&d公司)以1:5000的比例稀释，以100μl/孔的量加入到酶标板中，37℃孵育1h。洗板后加100μl/孔的tmb室温显色30min，加入100μl/孔的2mol/lh2so4终止显色反应，置酶标仪上测定450nm波长处测定吸光值，以样品浓度为横坐标，吸光度平均值为纵坐标，四参数方程曲线拟合。em201(cho-k1-fs-/-表达)为不含核心岩藻糖的糖型的抗cd20的抗体；em201(cho-k1表达)是以核心岩藻糖的糖型(>84％比例)为主的抗cd20的抗体；gazyva为部分含有核心岩藻糖的糖型(～50％比例)为主的抗cd20的抗体。em201(cho-k1-fs-/-表达)、em201(cho-k1表达)和gazyva(genentech公司)与fcγriiia(158v)的结合活性实验结果如图4所示，实验结果表明em201(cho-k1-fs-/-表达)与fcγriiia(158v)的结合活性约为gazyva的2倍，更是显著强于em201(cho-k1表达)的结合活性(约6倍)，表明无岩藻糖基化抗cd20抗体对fcγriiia具有更高的亲和力。实施例10抗cd20抗体的对人b细胞淋巴瘤daudi细胞的adcc效应人burkitt's淋巴瘤细胞系daudi细胞购自美国典型培养物保藏中心(atcc)，作为adcc测试中的靶细胞；以细胞膜上高表达fcγrⅲa的nk-92mi-cd16a为效应细胞(华博生物医药技术有限公司)。96孔板中每孔加入5×104个nk-92mi-cd16a和1×104个40μldaudi细胞；将em201(cho-k1-fs-/-表达)、em201(cho-k1表达)、gazyva(genentech公司)分别加入96孔板中，至样品终浓度1×10-1～1×10-8μg/ml(10倍梯度，共8个浓度点)，37℃、5％co2细胞培养箱中培养4h。用乳酸脱氢酶ldh测试剂盒显色后酶标仪492nm处读取od值，计算靶细胞裂解率，以样品浓度为横坐标，靶细胞裂解率为纵坐标，四参数方程拟合分析。em201(cho-k1-fs-/-表达)、em201(cho-k1表达)和gazyva(genentech公司)的adcc活性实验结果如图5所示，实验结果表明em201(cho-k1-fs-/-表达)adcc活性约为gazyva的4倍，更是显著强于em201(cho-k1表达)的adcc活性(约为20倍)，表明无岩藻糖基化抗cd20抗体比岩藻糖基化抗体具有更高的adcc效能。实施例11抗cd20抗体对人b细胞淋巴瘤daudi裸小鼠皮下移植瘤的疗效为评估抗cd20抗体的体内抗肿瘤活性，采用balb/ca-nude裸小鼠(6-7周，♀，购自上海灵畅生物科技有限公司)为宿主的人肿瘤移植模型。裸小鼠皮下接种人b细胞淋巴瘤daudi细胞，待肿瘤生长至130-180mm3后，将动物随机分组。将空白对照(pbs)和三种抗cd20抗体：em201(cho-k1-fs-/-表达)、em201(cho-k1表达)和gazyva(genentech公司)分别给药，三种抗cd20抗体给药方案为3mg/kg，每周2次，共4次。每周测2-3次瘤体积，称鼠重，记录数据。结果表明：如图6所示，空白对照组小鼠的肿瘤体积显著增大；与对照组相比，抗cd20的三组抗体都能显著抑制肿瘤的生长；em201(cho-k1-fs-/-表达)为不含核心岩藻糖的糖型的抗cd20的抗体；与以核心岩藻糖的糖型为主的em201(cho-k1表达)抗体，相比，具有较低的岩藻糖含量的抗体em201(cho-k1-fs-/-表达)和gazyva(genentech公司)具有更好的抑制瘤效果，且荷瘤小鼠对敲除岩藻糖的抗cd20抗体药物能很好耐受，没有体重减轻等症状发生。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。sequencelisting<110>江苏东抗生物医药科技有限公司<120>一种生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系及其建立方法<160>30<170>patentinversion3.5<210>1<211>449<212>prt<213>人源<400>1glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser151015servallysvalsercyslysalaserglytyralaphesertyrser202530trpileasntrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyargilepheproglyaspglyaspthrasptyrasnglylysphe505560lysglyargvalthrilethralaasplysserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasnvalpheaspglytyrtrpleuvaltyrtrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphe115120125proleualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleu130135140glycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrp145150155160asnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleu165170175glnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproser180185190serserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislyspro195200205serasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplys210215220thrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglypro225230235240servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileser245250255argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasp260265270progluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn275280285alalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargval290295300valservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglu305310315320tyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulys325330335thrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthr340345350leuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthr355360365cysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglu370375380serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu385390395400aspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplys405410415serargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglu420425430alaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserprogly435440445lys<210>2<211>219<212>prt<213>人源<400>2aspilevalmetthrglnthrproleuserleuprovalthrprogly151015gluproalaserilesercysargserserlysserleuleuhisser202530asnglyilethrtyrleutyrtrptyrleuglnlysproglyglnser354045proglnleuleuiletyrglnmetserasnleuvalserglyvalpro505560aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile65707580serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysalaglnasn859095leugluleuprotyrthrpheglyglyglythrlysvalgluilelys100105110argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu115120125glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe130135140tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln145150155160serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser165170175thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu180185190lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser195200205provalthrlysserpheasnargglyglucys210215<210>3<211>1098<212>dna<213>鼠源<400>3atgaacagggcgcctctgaagcggtccaggatcctgcgcatggcgctgactggaggctcc60actgcctctgaggaggcagatgaggacagcaggaacaagccgtttctgctgcgggcgctg120cagatcgcgctggtcgtctctctctactgggtcacctccatctccatggtattcctcaac180aagtacctgctggacagcccctccctgcagctggatacccctatcttcgtcactttctac240caatgcctggtgacctctctgctgtgcaagggcctcagcactctggccacctgctgccct300ggcaccgttgacttccccaccctgaacctggaccttaaggtggcccgcagcgtgctgcca360ctgtcggtagtcttcattggcatgataagtttcaataacctctgcctcaagtacgtaggg420gtggccttctacaacgtggggcgctcgctcaccaccgtgttcaatgtgcttctgtcctac480ctgctgctcaaacagaccacttccttctatgccctgctcacatgtggcatcatcattggt540ggtttctggctgggtatagaccaagagggagctgagggcaccctgtccctcataggcacc600atcttcggggtgctggccagcctctgcgtctccctcaatgccatctataccaagaaggtg660ctcccagcagtggacaacagcatctggcgcctaaccttctataacaatgtcaatgcctgt720gtgctcttcttgcccctgatggttctgctgggtgagctccgtgccctccttgactttgct780catctgtacagtgcccacttctggctcatgatgacgctgggtggcctcttcggctttgcc840attggctatgtgacaggactgcagatcaaattcaccagtcccctgacccacaatgtatca900ggcacagccaaggcctgtgcgcagacagtgctggccgtgctctactatgaagagactaag960agcttcctgtggtggacaagcaacctgatggtgctgggtggctcctcagcctatacctgg1020gtcaggggctgggagatgcagaagacccaagaggaccccagctccaaagagggtgagaag1080agtgctatcagggtgtga1098<210>4<211>28<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(26)..(26)<22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