调控糖基化修饰的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种调控方法，特别是涉及一种调控糖基化修饰的方法。
【背景技术】
[0002]哺乳动物细胞培养生产的单克隆抗体药物具有明显优势，主要是活性高、糖基化修饰正确，能够保证产品中二硫键等复杂蛋白结构的正确形成。
[0003]哺乳动物细胞培养生产的抗体药物有许多是糖蛋白，其含有共价连接的糖类结构。而糖链的结构和其中各种糖基的含量在糖蛋白的功能中起到重要作用，包括促进糖蛋白的正确折叠、介导蛋白质-蛋白质相互作用、赋予稳定性、赋予有利的药物动力学和/或药物代谢动力学性质、抑制蛋白酶解消化、将糖蛋白靶向正确的分泌途径和将糖蛋白靶向一个或多个特定器官。因此，糖基化水平是单抗药物的重要参数。
[0004]近年来，全球销量最大的生物原研药的专利已经或者不久将到期，比如全球10大销售额最大的10种生物药(最高每年82亿美元，最低每年24亿美元)其专利到期时间均集中在2012年到2019年间。随着生物药专利或数据排他期已经或即将过去，在全球范围内掀起了一股开发“生物仿制药”的热潮，然而生物仿制药的质量水平是否与原药一致，是毒理研究和临床实验的先决条件，也是审批的关键，即要求该生物仿制药的各项质量参数能达到与原产品一致或相似，才能保证同水平的药效。
[0005]我国目前的单抗仿制药和单抗新药现状与国际水平相比还有一定差距，主要表现是产品糖基化水平与标准品不吻合，进而导致抗体产品活性不理想或毒副作用大等，而且国内还没有有效的调整糖基化水平的方法，从而限制了我国抗体药物产业化的发展。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种调控糖基化修饰的方法。针对现有哺乳动物细胞培养工艺的缺点和抗体仿制药对糖型的特殊要求，本发明建立的调控糖基化修饰的细胞培养方法，能有效地调控糖基化修饰类型，在抗体仿制药方面能与原产品一致或相似。
[0007]为解决上述技术问题，本发明的调控糖基化修饰的方法，包括:以下的方法I或方法II;
[0008]( I)方法 I
[0009]调整表达抗体的细胞株的基础培养基和补料培养基的配比，进行表达抗体的细胞株的培养，从而调控抗体的糖基化修饰(即调控抗体的糖基化水平);
[0010](2)方法 II
[0011]通过流加补料培养基，进行表达抗体的细胞株的培养，从而调控抗体的糖基化修饰(即调控抗体的糖基化水平)。
[0012]所述方法I中，基础培养基包括:多宁S4基础培养基(Duoning公司)和HycloneHycell基础培养基(Hyclone公司);其中，多宁S4基础培养基与Hyclone Hycell基础培养基的体积比范围为9:1?1:9，优选1:1。
[0013]方法I中，补料培养基包括:多宁2X105 (Duoning公司)；其中，补料培养基的流加总量为基础培养基体积的20%?50% ;优选地，补料培养基的加入过程可为如下:
[0014]在进行表达抗体的细胞株的培养中，在第3天加入5% (体积百分比)多宁2X 105补料培养基，第6天加入10% (体积百分比)多宁2X 105补料培养基，第8天加入10% (体积百分比)多宁2 X 105补料培养基，第10天加入10% (体积百分比)多宁2 X 105补料培养基。
[0015]方法I中，表达抗体的细胞株包括:中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)。
[0016]方法I中，表达抗体的细胞株的培养温度为30°C?38°C，培养周期为9天?20天。
[0017]所述方法II中，补料培养基包括:多宁公司的2X210补料培养基，其中，补料培养基流加总量为基础培养基体积的20%?50% ;优选地，补料培养基的加入过程可为如下:
[0018]在进行表达抗体的细胞株的培养中，在第3天加入5% (体积百分比)多宁2X210补料培养基，第6天加入10% (体积百分比)多宁2X210补料培养基，第8天加入10% (体积百分比)多宁2X210补料培养基，第10天加入10% (体积百分比)多宁2X210补料培养基，第12天加入5% (体积百分比)多宁2X210补料培养基。
[0019]方法II中，对于表达抗体的细胞株的培养中的基础培养基，没有限制特定，可为常规的基础培养基，包括=Hyclone公司的SFM4系列基础培养基、Hyclone公司的HycellCHO基础培养基、CD Forti CHO基础培养基(Invitrogen公司)、Cell Boost5基础培养基(Hyclone 公司)或 CD Opti CHO 基础培养基(Life technology 公司)等。
[0020]方法II中，表达抗体的细胞株包括:中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)。
[0021]方法II中，表达抗体的细胞株的培养温度为30°C?38°C，优选36.5°C ;培养周期为9天?20天，优选14天。
[0022]本发明中，采用方法I可以有效地降低抗体糖基化中GOF的含量，提高抗体糖基化中GlF的含量。采用方法II可以有效地提高抗体糖基化中GOF的含量，降低抗体糖基化中GlF的含量。
[0023]本发明能有效地调控糖基化修饰类型，相对于国际上通过对细胞株的基因改造来调控糖基化修饰的方法，本发明能够广泛的适用于抗体仿制药和抗体新药的开发和产业化。
【附图说明】
[0024]下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明:
[0025]图1是实施例1中的细胞株A在工艺A (Hyclone SFM4和Hyclone CB5以体积比9:1混合的基础培养基与多宁2X 103A补料培养基搭配的工艺)和工艺B (多宁S4和Hyclone Hycell以体积比1:1混合的基础培养基与多宁2X 105补料培养基搭配的工艺)中所生产的抗体糖基化含量图，其中，图中A表示工艺A，B表示工艺B。
[0026]图2是实施例2中的细胞株B用补料2 X 103A工艺的摇瓶a和用补料2 X 210工艺的摇瓶b中的抗体糖基化含量图，其中，图中a表示摇瓶a，b表示摇瓶b。
[0027]图3是实施例3中的细胞株C用补料2 X 103A工艺的摇瓶c和用补料2 X 210工艺的摇瓶d中的抗体糖基化含量图，其中，图中c表示摇瓶c，d表示摇瓶d。
【具体实施方式】
[0028]实施例1细胞株A进行美罗华(Rituximab)抗体糖基化修饰的调控
[0029]为确定基础培养基(多宁S4和Hyclone Hycell以体积比1:1混合)与多宁2X 105补料培养基搭配对糖基化修饰的调控，将细胞株A【中国仓鼠卵巢细胞(CH0)，购自Eureka公司】以8.0父105细胞/11^分别在3011^ Hyclone SFM4和Hyclone CB5以体积比9:1混合的基础培养基、30mL多宁S^PHyclone Hycell以体积比1:1混合的基础培养基中，在125mL摇瓶中以 37°C、6%C02、125RPM振荡下培养。第 3 天时在 30mL Hyclone SFM4 和 Hyclone CB5以体积比9:1混合的培养物中加入5% (体积百分比)多宁2X 103A补料培养基，在30mL多宁S4和Hyclone Hycell以体积比1:1混合的培养物中加入5% (体积百分比)多宁2X 105补料培养基；第6天时在30mL Hyclone SFM4和Hyclone CB5以体积比9:1混合的培养物中加入10% (体积百分比)多宁2X103A补料培养基，在30mL多宁S4和Hyclone Hycell以体积比1:1混合的培养物中加入10% (体积百分比)多宁2X 105补料培养基；第8天时在30mL HycloneSFM4和Hyclone CB5以体积比9:1混合的培养物中加入10% (体积百分比)多宁2X103A补料培养基，在30mL多宁S4和Hyclone Hycell以体积比1:1混合的培养物中加入10% (体积百分比)多宁2X 105补料培养基，第10天时在30mL Hyclone SFM4和Hyclone CB5以体积比9:1混合的培养物中加入10% (体积百分比)多宁2X103A补料培养基，在30mL多宁S4和Hyclone Hycell以体积比1:1混合的培养物中加入10% (体积百分t匕)多宁2X105补料培养基。
[0030]在第3、6、8、10、12天，分别用贝克曼公司的细胞计数仪检测细胞密度、活率，用美国NOVA公司的生化分析仪检测营养物质。如果葡萄糖浓度低于3g/L，会补充到8?1g/L0当活率低于60%时，或达到14天收取上清。收取上清后，用高效液相色谱(HPLC)的方法，通过Protein A柱收集纯的美罗华(Rituximab)抗体。
[0031]糖基分析方法为:用内切糖苷酶(PNGase F)将寡糖从美罗华(Rituximab)抗体上分离，经冰乙醇沉淀蛋白后得到含寡糖的上清液。真空干燥除去上清液中的乙醇，将干燥后的多糖胶状物用2-氨基-苯甲酰胺(2-AB)标记带上荧光基团，适用于HPLC-FLD分离鉴定。通过比较样品与标准品的色谱图，鉴定样品蛋白的寡糖种类，并且根据不同类型的寡糖吸收峰面积计算其相对百分比值。
[0032]本实施例中的HPLC 仪器型号为:Agilent Techno1gies1260Infinity with FLD(G