一种降解pfoa菌株yab-1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物及环境保护技术领域，具体指一种降解PFOA菌株YAB-I及其应用 YAB-I降解PFOA的方法。
【背景技术】
[0002] 全氟辛酸类化合物（Perfluorinated octylic acid compounds)指 C7F15COOH 及 其衍生物。其中全氟辛酸（Perfluorooctanoic Acid，简称PF0A)别称十五氟辛酸，分子式 SC8HF15O2，分子量为414. 07 g/mol，密度为1.8 g/cm3,水中溶解度为3.4 g/L;溶于极性有 机溶剂。
[0003] PFOA是人工合成的表面活性剂，由于F具有最大的电负性，使得C-F的键能较 大，为460 kj/mol，是自然界中键能最大的共价键之一，因而具有很高的化学、生物和热稳 定性。但PFOA由于其独特的疏水疏油性质，被广泛用于纺织、造纸、食品包装、地毯、皮革和 灭火泡沫等制造工业产品和日用消费品。
[0004] 很多研宄表明，因为PFOA的稳定性，使其在环境中很难自然的降解，因此在全球 各个水域、各区域的动物和人体内都检测到了 PFOA的存在。由于PFOA具有持久性、生物 累积性、致癌、致畸、致突变性及内分泌干扰等特性，对生态环境和人类健康构成重大危害。 2009年《斯德哥尔摩公约》将PFOA列为新型持久性环境污染物。
[0005] 目前，国内外降解PFOA的方法主要包括化学降解法、物理降解法和生物降解法。 化学降解PFOA的方法包括紫外光化学降解法、水热电化学氧化法等，但是这些方法成本非 常高并且效率低；物理降解PFOA的方法主要是光降解法和超声波降解法，虽然价格没有化 学降解法那么昂贵，但降解效果不明显，且容易产生二次污染物。
[0006] 微生物降解氟类有机化合物已经有氟代苯、氟苯胺、多氟双酚、氟代调聚醇和氟代 调聚磺酸盐等报道，这些研宄结果表明，自然界中一些微生物存在脱氟酶，能对碳氟键发生 攻击。但目前从自然界中分离筛选到的一些降解PFOA菌株，其降解能力都非常弱、且菌种 资源也非常稀缺，难以能满足环境污染治理的需求。
[0007] 因此，加大对PFOA类持久性有机污染物的降解研宄，筛选高效的PFOA降解菌株， 为后续的降解机理研宄和菌株改良提供优良的种质资源，无论是对于生物技术本身，还是 环境保护都具有重要意义。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题就是克服现有技术的不足，提供一种高效降解PFOA的 菌株及其降解PFOA的方法。
[0009] 本发明人于2013年4月18日在武汉氟化工厂采集长期受PFOA污染的土壤样品。 从该样品中分离得到一种降解PFOA菌株YAB-I)，该PFOA 降解菌为类黄色假单胞菌/7<ara/i/7ra)，保藏编号：CCTCC NO :M2015280,保藏 日期：2015年5月7日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大 学。
[0010] 所述菌株YAB-I的筛选和分离步骤包括： 1、取样：样品取自于长期受氟化物污染的土壤，在低温下带回实验室保存待用。
[0011] 2、驯化：采用梯度压力法驯化样品。按10%的接种量接种样品至含PFOA浓度为50 mg/L的驯化培养基中培养2周，随后每2周将PFOA浓度提高50 mg/L继续培养，直至PFOA 浓度达到500 mg/L时，驯化结束，整个驯化共为期10周。
[0012] 3、分离纯化：在无菌条件下，移取I mL驯化液做梯度稀释，将不同稀释倍数的菌 液涂布于无机盐离子培养基平板上，30 °C培养，挑取生长状态良好的单菌落划线分离，获 得1株以PFOA为惟一碳源生长的纯菌株。
[0013] 驯化培养基配置：1000 mL蒸馏水中加入！NH4NO3 5 g，NaCl 2 g，KH2PO4 I g，K2HPO4I g，MgS04 7H20 0.5 g，CaCl22H20 0.05 g，酵母膏 I g 和不同质量的 PF0A，调 pH 至 7· 0,121°C灭菌 30 min。
[0014] 分离纯化培养基配置：1000 mL蒸馏水中加入！NH4NO3 5 g，NaCl 2 g，KH2PO4 I g， K2HPO4 I g ,MgSO4 7H20 0· 5 g，CaCl22H20 0· 05 g，PF0A 500 mg，琼脂 18 g，调pH到7· 0， 121 °C灭菌 30 min。
[0015] 本发明的另一个目的是提供一种利用菌株YAB-I ( YAB-I)降解含PFOA物料的方法，该方法包括如下步骤： 先将YAB-I单菌落接种至LB培养基12-18小时，然后将这个培养基制成一定0D_的 菌悬液，最后用这个菌悬液处理含PFOA的物料。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： 本发明提供了一种新的降解PFOA菌株YAB-I)及其利 用这种菌株处理含PFOA物料的方法。该菌株降解PFOA能力强，是一种能够以PFOA为惟一 碳源生长的菌株，当环境条件为：温度30°C、pH=7、接种量2%、PFOA初始浓度500 mg/L时， 接种菌株YAB-I至无机盐离子培养基中振荡培养，经GC-MS测定，PFOA的降解率达32. 4%。 利用菌株YAB-I YAB-1)处理含PFOA物料的方法简单、有效，能 显著降低物料中PFOA的浓度。
【具体实施方式】
[0017] 现结合具体实施例对降解PFOA菌株YAB-I及其应用进一步具体说明。
[0018] 本发明人于2013年4月18日采集武汉氟化工厂采集长期受PFOA污染的土壤样 品，从该样品中分离得到一种降解PFOA菌株YAB-1 (Fa YAB-1)， 该PFOA降解菌为类黄色假单胞菌/7<ara/Wra)，保藏编号：CCTCC NO : M2015280,保藏日期：2015年5月7日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中 国武汉武汉大学。
[0019] 菌株YAB-I的筛选方法、步骤如下： 1、采集不同样地样品混匀，四分法取样，留10 g样品待用。
[0020] 2、样品的驯化：取10 g样品，接入90 ml富集培养基，培养2周后，转入含PFOA浓 度50 mg/L的无机盐培养基，逐渐提高PFOA浓度驯化培养，每个浓度梯度驯化2周，当PFOA 浓度达到500 mg/L时继续培养2周，驯化结束。
[0021] 3、菌株的分离纯化：取不同稀释倍数的驯化菌液涂布于分离培养基平板，选择生 长状态良好，形态不同的菌落，采用反复平板划线分离，获得1株以PFOA为惟一碳源生长的 纯菌株YAB-I。
[0022] 4、菌株的鉴定：对菌株进行形态、生理生化鉴定和16S rDNA序列测定。
[0023] (1 )、采用CTAB法提取细菌YAB-I总DNA。
[0024] (2)、PCR 扩增：以菌株 DNA 为模板，利用通用引物（PA :5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， 和 PB : 5, -TTMGGTGATCCAGCCGCA-3,)进行 PCR 扩增。
[0025] (3)、PCR 反应体系：DNA 模板 2 μ L，10 X PCR Reaction Buffer 5 μ L，dNTPs 4 μ L，引物各 1 μ L，Taq 酶 0.25 μ L，去离子水 36. 75 μ L。
[0026] (4)、PCR 扩增程序：95 °C 预变性5 min，95 °C变性30 s，54 °C退火30 s，72 °C 延伸90 s，进行30个循环，最后72 °C延伸10 min。
[0027] (5)、数据处理：PCR产物由宝生物工程有限公司进行测序，测序结果提交到 GenBank，并进行BLAST分析，利用Clustal X2进行多序列比对，通过MEGA 4软件采用 neighbor-j〇ining方法构建系统发育树，对分离菌株进行分类。
[0028] 5、环境条件对菌株的生长和降解PFOA的影响：采用"单因素实验法"分别考察 PFOA初始浓度、接菌量、初始pH、温度对菌株YAB-I的生长和降解PFOA的影响。将处于对 数生长期的菌株YAB-I(原菌悬液的吸光度0D_为2. 0)接种至含PFOA的培养基中，于160 r/min振荡培养，并做平行实验3次，每隔12 h取样测定菌株YAB-I的生长和降解曲线。
[0029] (1)、单因素设置如下：底物浓度为100、200、500、800和1000 mg/L ;接菌量为 0· 5%、1%、2%、5% 和 10% ;pH 值为 5、6、7、8 和 9 ;温度为 20、25、30、35 和 40 °C。
[0030] (2 )、PFOA的测定方法： a.样品浓缩：发酵液经5000 r/min离心5 min后，取5 mL至干净离心管，加入甲基叔 丁基醚I mL超声萃取10 min，静止分层，收集有机相，样品重复萃取3次，合并上层有机相。
[0031] b.样品衍生：加入I mL BSTFA充分混匀后，密封，置于40 °C水浴中衍生化反应1 h，用正己烧定容至10 mL。
[0032] c.样品测定：选用内标法进行GC-MS (SM)定量分析，根据浓度与峰面积比的标 准曲线计算PFOA的浓度。
[0033] (3)、菌体浓度测定：菌体浓度采用比浊法测定。本实验的菌体细胞浓度以OD6c?来 表示，即波长为600 nm时，紫外光透过所测菌液样品的光密度值。
[0034] 6、结果：从长期受氟化物污染的环境样品中分离1株细菌，命名为YAB-1，经鉴定 YAB-1 为黄色假单胞菌Fa) 〇
[0035] 分离菌株的同源性分析和分类结果
先将YAB-I单菌落接种至LB培养基16小时，然后将这个培养基制成一定OD的菌悬液， 最后用这个菌悬液处理含PFOA的物料，能有效降低物料中PFOA的浓度。
[0036] PFOA初始浓度对菌株生长和PFOA降解的影响：当PFOA浓度小于500 mg/L时，同 时期的菌液〇D_值随底物浓度增大而增大。当PFOA高于500 mg/L时，菌液OD 6(J直随着 PFOA浓度增大而变小。当PFOA浓度为500 mg/L时，培养基中生物量最大，降解效果也最 高，PFOA的最大降解率为32. 4%。
[0037] 接菌量对菌株生长和PFOA降解的影响：当接菌量为1%和2%时，菌株的生长符合 典型的指数生长曲线模型，同时菌株的生物量和PFOA的降解能力随接菌量的增大而提高， 但当接菌量大于2%时，菌株的生长受到明显抑制，因此菌株YAB-I降解PFOA的最适接种量 为2%。
[0038] pH值对菌株生长和PFOA降解的影响：微生物都有最适宜生长和繁殖的pH值。随 着pH的升高，菌株的生长和降解率先升高后降低，当培养基pH=7. 0时，96 h时菌液0D_和 降解率达到最高，分别为0. 181和28. 9%。菌株YAB-I有较宽的pH范围适应，最适pH值为 7. 0〇
[0039] 温度对菌株生长和PFOA降解的影响：在培养温度为2 0 °C -40 °C时，菌株YAB-I 均能生长良好。当温度为20°C时，菌株YAB-I生物量和PFOA降解率显著低于30 °C和40 °C。30 °C时菌株生长量和PFOA降解率均达到最高。培养温度为30 °C是菌株生长和降解 PFOA的最适温度。
【主权项】
1. 一种降解 PFOA 菌株 YAB-1 ( 饥/para/Wra YAB-1)，该 PFOA 降解菌为类 黄色假单胞菌（/?^饥/网ra/Wra)，保藏编号：CCTCC N0:M2015280,保藏日期：2015 年5月7日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。2. -种利用菌株YAB-1 (/?^饥YAB-1)降解含PFOA物料的方法， 其特征在于：先将YAB-I单菌落接种至LB培养基12-18小时，然后将这个培养基制成一定 OD6。。的菌悬液，最后用这个菌悬液处理含PFOA的物料。
【专利摘要】本发明公开了一种降解PFOA菌株YAB-1及其应用，该PFOA降解菌为类黄色假单胞菌（Pseudomonas parafulva），保藏编号：CCTCC NO：M2015280，保藏日期：2015年5月7日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。利用菌株YAB-1降解含PFOA物料的方法为：先将YAB-1单菌落接种至LB培养基12-18小时，然后将这个培养基制成一定OD600的菌悬液，最后用这个菌悬液处理含PFOA的物料。本发明提供了一种降解PFOA菌株YAB-1及其利用这种菌株处理含PFOA物料的方法。该菌株降解PFOA能力强，处理含PFOA物料的方法简单、有效，能显著降低物料中PFOA的浓度。CCTCC NO：M201528020150507
【IPC分类】C12R1/01, C12N1/20, A62D101/28, A62D3/02
【公开号】CN104974969
【申请号】CN201510446268
【发明人】易浪波, 彭清静, 唐崇俭, 彭清忠, 柴立元
【申请人】吉首大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年7月28日