一株不动杆菌属解磷促生细菌y40及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业微生物领域，提供一株不动杆菌属解磷促生细菌Y40及其应用。
【背景技术】
[0002] 磷是植物生长必不可少的营养元素，我国耕地缺磷现象普遍，土壤中无效磷形态 占到95 %，植物几乎不能直接吸收利用。土壤中难溶性磷可分为有机磷和无机磷，其中难溶 性有机磷占土壤全磷的20% -50%。过磷酸钙等磷肥的有效磷含量偏低，而且施用后磷肥 当季利用率为5% -25%，剩余大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe3+以及Al 3+等结合形成难溶性 磷酸盐，因此，如何提高磷利用率是一个急需解决的问题。植物根际的解磷菌数量不足以和 其他微生物竞争，难以发挥其活性。固氮、解磷、解钾菌株是微生物肥料的主要菌株，因此， 有必要从植物根际自然条件下筛选高效解磷菌株，制成微生物菌剂回接到土壤中，确保该 类微生物能够有效定殖于植物根际，以促进植物生长。一些研宄者提出一个方案：通过开发 高效解磷微生物肥料，减少化学肥料的使用来提高土壤中有效磷的含量。同时，一些研宄者 经过试验证实解磷菌与有机肥料在一起能发挥更好的解磷作用。因此，本发明正好把二者 很好地结合起来。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株具有解磷作用的不动杆菌属 解磷促生细菌。
[0004] 本发明的另一目的是提供该细菌的应用。
[0005] 本发明的又一目的是提供该细菌制备的生物肥料及其应用。
[0006] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0007] 一株乙酸钙不动杆菌Y40,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏日期为2014年12月25日，保藏编号为CGMCC NO. 10241。
[0008] 菌株Y40在LB平板上的菌落呈乳白色，皱褶，边缘不整齐，具有一定的黏性，易挑 起。在显微镜下所观察到的营养体细胞，革兰氏染色阴性，菌体着色均匀，呈球杆状，两端钝 平，呈不规则形状。淀粉水解反应，V. P反应，接触酶反应，利用柠檬酸盐反应，甲基红反应， 明胶液化反应均呈阳性，葡萄糖，阿拉伯糖，葡萄糖酸盐，癸酸，己二酸，苹果酸，苯乙酸利用 均呈阳性。7% NaCl生长。菌株16S rDNA序列构建的系统发育树分析表明，菌株Y40位 于Acinetobacter calcoaceticus分支上，结合生理生化试验将Y40鉴定为不动杆菌属细 菌。
[0009] 本发明所述的乙酸钙不动杆菌Y40在促溶解土壤中难溶性磷和/或进植物生长中 的应用。
[0010] 本发明所述的乙酸钙不动杆菌Y40在制备促溶解土壤中难溶性磷和/或进植物生 长的生物肥料中的应用。
[0011] 由本发明所述的乙酸钙不动杆菌Y40制备的解磷促生生物肥料。
[0012] 所述的解磷促生生物肥料优选主要通过以下方法制备：将保藏号为CGMCC NO. 10241的不动杆菌属细菌Y40接种到LB培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件 为：pH值自然，发酵温度范围30~35°C，搅拌速度为170~200转/分钟，发酵时间为40h， 使发酵液中含菌量多IX 101°个/mL。
[0013] 所述的解磷促生生物肥料进一步优选得到发酵液后将其按照常规方法制备为其 他的生物肥料常用剂型，优选制备为粉剂、颗粒剂或悬浮剂。
[0014] 本发明所述的解磷促生生物肥料在促溶解土壤中难溶性磷和/或进植物生长中 的应用。
[0015] 所述的应用，优选将所述的发酵液8000~10000r/min离心5~IOmin后，采用等 体积0.9% (g/100ml)的生理盐水重悬菌体，然后直接加至植物根际。以降低成本为基准， 添加量优选按照3% (ml/100g)进行。
[0016] 有益效果
[0017] 本发明主要利用Y40菌株能够根际有益，高效定殖于植物根际，发挥解磷作用，将 土壤中难溶性磷转化为植物可以吸收利用的可溶性磷，从而促进作物生长。专利产品应用 后，促生效果好，适合蔬菜作物产区大面积使用。
[0018] 该菌株及其效应验证与其它菌株相比具有如下优点：
[0019] 1)本发明所获得的解磷菌株Y40为不动杆菌属高效解磷细菌，分离于植物根际， 因此，应用时，相比于其他菌株能够更加有效的在植物根际大量定殖，从而高效发挥解磷促 生功能，具有显而易见的优势。
[0020] 2)研宄结果表明，本专利分离获得的解磷菌Y40,在多季盆栽试验中表现出显而 易见的稳定促生能力。
【附图说明】
[0021] 图1基于菌株Y40的16S rDNA基因序列采用邻接法建立的系统发育树
[0022] 图2第一季番茄促生盆栽效果图
[0023] 图3第二季番茄促生盆栽效果图
[0024] 图4第一季前子促生盆栽效果图
[0025] 图5第二季茄子促生盆栽效果图
[0026] 图6解磷菌Y40根际定殖情况图
[0027] 生物材料保藏信息
[0028] 菌株Y40,分类命名为乙酸妈不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus，保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研宄所，保藏日期为2014年12月25日，保藏编号为CGMCC NO. 10241。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1、功能菌株的分离及鉴定
[0030] 剪取5g马铃薯根至盛有45mL无菌水的三角瓶中，170rpm振荡30min制成悬液，然 后依次配备浓度为1〇_3、1〇_4、1〇_5、1〇_6的土壤稀释液。从10_ 4、1〇_5、1〇_6稀释液中取0.1 mL溶 液分别涂布于磷酸钙盐无机磷培养基和卵黄培养基上（每个浓度在各培养基上重复3次）。 分离解有机磷和无机磷细菌平板分别在30°C下培养2-3d和5-7d后，取出观察，选择在固体 培养基平板上产生透明圈的菌落初步认定为解磷细菌，划线纯化后，于4°C冰箱保存留待进 一步研宄。
[0031] 其中所用磷酸钙盐无机磷培养基配制方法为，以配制IL培养基为例：葡萄糖10g， (NH4) 2S040. 5g，NaCl 0· 3g，KCl 0· 2g，FeSO4 · 7H20 0· 03g，MnSO4 · H2O 0· 03g，Ca3 (PO4) 25g，卵 黄培养基：葡萄糖 l〇g，（NH4)2SO4O. 5g，NaCl 0· 3g，KCl 0· 2g，FeSO4 ·7Η20 0· 03g，MnSO4 · H2O 0· 03g，蛋黄液10mL，用去离子水定容至1000mL，pH 6. 0-6. 5,琼脂18_20g，115°C下灭菌 30min。蛋黄液的制备：在超净工作台上，先用棉花蘸取适量的酒精把鸡蛋的外壳擦干净，一 般进行三次擦洗。接着用已经用酒精擦洗过的镊子在鸡蛋壳的一端敲开小孔，卵清液流入 灭菌的小锥形瓶中，剩下的卵黄液让其流入已灭菌的试剂瓶中，再按照蛋黄液：〇. 9%的灭 菌生理盐水等体积混合后放冰箱中备用。最终分离获得一株菌株命名为Y40,具有优异的解 磷效果。
[0032] 菌株Y40在LB平板上的菌落呈乳白色，皱褶，边缘不整齐，具有一定的黏性，易挑 起。在显微镜下所观察到的营养体细胞，革兰氏染色阴性，菌体着色均匀，呈球杆状，两端钝 平，呈不规则形状。淀粉水解反应，V. P反应，接触酶反应，利用柠檬酸盐反应，甲基红反应， 明胶液化反应均呈阳性，葡萄糖，阿拉伯糖，葡萄糖酸盐，癸酸，己二酸，苹果酸，苯乙酸利用 均呈阳性。7%似(：1生长。菌株163扣嫩序列构建的系统发育树见图1。菌株￥40位于 Acinetobacter calcoaceticus分支上，结合生理生化试验将Y40归类为Acinetobacter calcoaceticus，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC NO. 10241。
[0033] 实施例2、功能菌灌菌菌悬液的生产
[0034] 将菌株Y40(CGMCC NO. 10241)接种至LB培养液中液体发酵生产，发酵生产的条件 为：pH 6. 0~7. 0,发酵温度范围30~35°C，搅拌速度为170~200转/分钟，发酵时间为 40h，