一种高温堆肥促腐细菌复合菌剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种堆肥菌剂及其应用。本发明所提供的堆肥菌剂的活性成分为CFU配比为（3～5）：（1～2）：（1～2）：（1～2）：（1～2）的热纤梭菌、嗜热脂肪地芽胞杆菌、台湾假黄单胞菌、土壤短芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。本发明所提供的菌剂中各菌株能良好共生，且在微好氧共培养条件下，可按比例有规律的增殖，高效分解木质纤维素。菌剂菌剂制造过程因共培养，其制造过程简单，分解功能稳定，保质期长。实验证明，使用该菌剂发酵堆肥，无需大量通气、节省能源，减少氮素损失；可提前完全腐熟，提高肥料质量。
【专利说明】一种高温堆肥促腐细菌复合菌剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种堆肥菌剂及其应用，特别涉及一种高温堆肥促腐细菌复合菌剂及其应用。
【背景技术】
[0002]堆肥化是自然界有机物分解，促进元素循环的重要环节，而随着生产集约化成都的提高和城市规模的扩大，废弃物集中越加严重的背景下，堆肥化技术是处理有机废弃物减轻环境压力和制造有机肥的重要途径。
[0003]堆肥化过程是在微生物的作用下，可分解的有机物全部分解，进入安全状态，部分元素矿化成为植物养分的过程。其过程可分为:糖类、淀粉、脂肪、蛋白等易分解物分解产热而升温阶段，伴随纤维素、半纤维素分解而持续产热的高温发酵阶段，以及剩余分解物继续分解和木质纤维素中脱落的木质素单元重新组合形成腐殖质的后熟阶段，这三个过程。其中第一阶段短暂，第二阶段是时间较长且堆肥化物质变化剧烈的关键阶段，第三阶段是相对温和的必经阶段，因此堆肥化进程的关键是第二阶段的长短。
[0004]作为堆肥化进程的促进手段，堆肥发酵菌剂的使用，越来越收到关注。但对堆肥化过程机理的理解不足和菌剂制造、使用技术的合理程度不同，其使用效果千差万别，其主要问题在于:①有些菌剂片面关注升温效果，选用分解易分解物的中温微生物类作菌剂，结果不具备关键成分木质纤维素的分解能力，高温期迅速消失，起不到期望的作用。②过分强调好氧条件，促使容易分解淀粉、脂肪、蛋白质等成分，而抑制了难分解物-木质纤维素，而不得不需要较长不通气的二次发酵阶段来分解难分解物，结果延长了堆肥腐熟的总时间。③堆肥发酵环境中使用的菌剂，菌剂组成菌都将处于同一环境中，因此这些成员菌是否可以在共同环境中都良好生长？是否功能上协同至关重要。但现有的大部分堆肥复合菌剂，都分别利用不同的培养条件各自培养菌种，人为强行混合制成菌剂。结果往往难以保证这些菌都能够存活，更难以期望其稳定的作用。`
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种堆肥菌剂。
[0006]本发明所提供的堆肥菌剂，其活性成分为热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus thermophilus)、台湾假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas taiwanensis)、土壤短芽抱杆菌(Brevibacillus agri)和地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)；
[0007]所述热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、所述嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus thermophilus)、所述台湾假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas taiwanensis)、所述土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)和所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的 CFU 配比为(3 ~5): (I ~2): (I ~2): (I ~2): (I ~2)，如 5:2:1:1:1。[0008]进一步，所述菌剂还可包括辅料，所述辅料具体可为如下(a)或(b):
[0009](a)由秸杆粉(如玉米秸杆粉、水稻秸杆粉或小麦秸杆粉)和碳酸钙按照质量比为(8~9): (I~2)的比例混合而成；所述秸杆粉的质量以干重计；
[0010](b)由谷壳粉(如稻壳粉、花生壳粉或麦麸粉)和碳酸钙粉按照质量比为(8~9):(I~2)的比例混合而成；所述谷壳粉的质量以干重计。
[0011]在本发明的一个实施例中，所述辅料具体由玉米秸杆粉和碳酸钙按照质量比为9:I的比例混合而成；所述玉米秸杆粉的质量以干重计；
[0012]更加具体的，在所述菌剂中，作为活性成分的所述热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、所述嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus thermophilus)、所述台湾假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas taiwanensis)、所述土壤短芽抱杆菌(Brevibacillus agri)和所述地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)的总量为(5X IO8~5X 101°) cfu/g所述菌剂，如5X109cfu/g所述菌剂。
[0013]所述菌剂中，水分的质量含量为10%以下，如8~10%，具体如10%。
[0014]本发明的再一个目的是提供所述菌剂的制备方法。
[0015]本发明所提供的所述菌剂的制备方法，具体可包括如下步骤: [0016](I)培养作为所述活性成分的各菌株；
[0017](2)按照满足如下al)_a3)的条件将作为所述活性成分的各菌株和所述辅料混合，得到所述菌剂:
[0018]al)在所述菌剂中，作为所述活性成分的所述热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、所述嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus thermophilus)、所述台湾假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas taiwanensis)、所述土壤短芽抱杆菌(Brevibacillus agri)和所述地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)的CFU配比为(3~5):(1~2):(1~2):(I ~2):(1 ~2)，如 5:2:1:1:1。
[0019]a2)为如下 a2_l)或 a2_2):
[0020]a2_l)在所述菌剂中，作为所述辅料的所述秸杆粉和碳酸钙的质量比为(8~9):(I~2),如9:1或8:2 ;所述稻杆粉的质量以干重计；
[0021]a2-2)在所述菌剂中，作为所述辅料的所述稻壳粉和碳酸钙的质量比为(8~9):(I~2),如9:1或8:2 ;所述稻壳粉的质量以干重计；
[0022]a3)在所述菌剂中，作为活性成分的所述热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、所述嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus thermophilus)、所述台湾假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas taiwanensis)、所述土壤短芽抱杆菌(Brevibacillus agri)和所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的总量为(5X IO8~5X 101°) cfu/g所述菌剂，如5X109cfu/g所述菌剂。
[0023]在所述方法的步骤(1)中，对作为所述活性成分的各菌株进行培养，既可以为将各菌株单独培养，也可以为将各菌株混合培养。
[0024]在所述方法的步骤(1)中，对作为所述活性成分的各菌株进行培养的培养基可为PCSl培养基或PCS2培养基；
[0025]所述PCSl培养基的溶剂为水，溶质及浓度具体如下:蛋白胨5g/L、酵母粉lg/L、氯化钠5g/L、碳酸|丐3g/L、滤纸或稻杆10g/L, pH6.5~8.5 ;[0026]所述PCS2培养基的溶剂为水，溶质及浓度具体如下:玉米蛋白5g/L、工业酵母粉lg/L、氯化钠5g/L、碳酸钙lg/L、滤纸或稻杆10g/L, pH6.5~8.5。
[0027]当培养体系在20L以下时可采用所述PCSl培养基，当培养体系超过20L时可采用所述PCS2培养基。
[0028]在所述方法的步骤(1)中，对作为所述活性成分的各菌株进行培养的条件具体可为:温度50~60°C (如55°C )，静止培养，控制发酵液溶氧量为0.1-0.5mg/L,时间48h~72h (如 72h)。
[0029]在本发明的一个实施例中，具体是按照包括如下步骤的方法制备所述菌剂的:
[0030](I)将活化的所述各菌株等量混合(5X 109cfu/ml, 1ml),接种到80倍体积的所述PClS培养基中，55°C静止培养3天，获得种子液；
[0031](2)将步骤(1)所得种子液按照1:50的体积比接种到所述PCSl培养基中，55°C静止培养，同时向培养体系中通入空气，使培养液中的溶氧量达到0.1-0.5mg/L，培养3天，获得混合菌株培养液；
[0032](3)将粒径为1mm左右玉米秸杆粉和碳酸钙粉按照质量比为9:1的比例(玉米秸杆粉的质量以干重计)混合，添加到步骤(2)所得混合菌株培养液中，使最终含水量达到70%(质量分数)，搅拌均匀后，停止通气，继续55°C静止培养I天，将培养物取出，55°C~60°C通风干燥，至含水量为10% (质量分数)，得到所述菌剂。
[0033]本发明的另一个目的是提供一种利用所述菌剂堆制堆肥的方法。
[0034]本发明所提供的利用所述菌剂堆制堆肥的方法，具体可包括如下步骤:
[0035](I)将所述菌剂和堆肥原料按照质量配比`为(0.2~0.5):100，如0.2:100，的比例混合，得到混合物；
[0036](2)用步骤(1)所得混合物堆制堆肥，堆制当天记为第I天，根据第3天的堆体温度按照如下进行翻堆:若第3天的所述堆体温度高于50°C，则自第3天起每天翻堆一次，至第12天；若第3天的所述堆体温度为50°C以下，则自第3天起隔天翻堆一次至第12天；
[0037](3)自第13天起，每3天翻堆一次，当所述堆体温度降至40°C以下并不再升高时，停止翻堆；将堆体放置至堆体中碳元素和氮元素的质量比小于20时，堆制结束。
[0038]在上述方法的步骤(3)中，自所述堆体温度降至40°C以下并不再升高时起，至堆体中碳元素和氮元素的质量比小于20时止，这段时间通常为20-30天。
[0039]在以上所提供的堆制堆肥方法中，自第I天起，至堆体温度首次高于50°C时止为升温阶段；自第3天起，至堆体温度降至40°C以下并不再升高时止为高温发酵期；之后的20-30天为后熟期。
[0040]在所述方法的步骤(1)中，所述堆肥原料的主要成分如下物质中的至少一种:菌糠、畜禽粪便(如牛粪、猪粪或鸡粪)、秸杆。
[0041]在本发明中，步骤(1)中所述的堆肥原料为如下(bl)_ (b7)中任一种:
[0042](bl)由菌糠、尿素、碳酸钙和水混合而成的堆肥原料I ;所述菌糠、所述尿素和所述碳酸钙的质量比为98:1:0.1，所述堆肥原料I中水分的质量分数为55~60%(如56%)。
[0043](b2)由牛粪、秸杆、返料A和水混合而成的堆肥原料2;所述牛粪、所述秸杆和所述返料A的质量比为80:10:10，所述堆肥原料2中水分的质量分数为55~60% (如55%)。
[0044](b3)由猪粪、秸杆、返料B和水混合而成的堆肥原料3;所述猪粪、所述秸杆和所述返料B的质量比为75:15:10，所述堆肥原料3中水分的质量分数为55~60% (如57%)。
[0045](b4)由鸡粪、秸杆、返料C和水混合而成的堆肥原料4;所述鸡粪、所述秸杆和所述返料C的质量比为70:15:15，所述堆肥原料4中水分的质量分数为55~60% (如58%)。
[0046](b5)由秸杆、牛粪和水混合而成的堆肥原料5 ;所述秸杆和所述牛粪的质量比为60:30，所述堆肥原料5中水分的质量分数为55~60% (如56%)。
[0047](b6)由秸杆、猪粪和水混合而成的堆肥原料6 ;所述秸杆和所述猪粪的质量比为60:20，所述堆肥原料6中水分的质量分数为55~60% (如56%)。
[0048](b7)由秸杆、鸡粪和水混合而成的堆肥原料7 ;所述秸杆和所述鸡粪的质量比为60:10，所述堆肥原料7中水分的质量分数为55~60% (如56%)。
[0049]在上述方法中，所述菌糠为包括木耳、香菇、平菇、双孢菇、金针菇、杏鲍菇等食用菌生产完剩下的栽培基质，经过去塑料皮，挫碎成自然颗粒后得到；在本发明的一个实施例中，所述菌糠具体为取自于黑龙江省东宁县三岔口镇三岔口村的木耳生产完剩下的废弃栽培基质经过去塑料皮，挫碎成自然颗粒后得到。所述秸杆为玉米秸杆(也可用水稻秸杆、小麦秸杆、油菜秸杆甘薯藤、烟草秸杆、花草枯枝落叶、花草割草等)，其粒径为2~5cm，水分质量分数为16%。所述返料A是指用初始堆肥原料2进行堆制所得堆肥；所述初始堆肥原料2与以上所述堆肥原料2相比仅缺少所述返料A，其余组成均相同。所述返料B是指用初始堆肥原料3进行堆制所得堆肥；所述初始堆肥原料3与以上所述堆肥原料3相比仅缺少所述返料B，其余组成均相同。所述返料C是指用初始堆肥原料4进行堆制所得堆肥；所述初始堆肥原料4与以上所述堆肥原料4相比仅缺少所述返料C，其余组成均相同。
[0050]在所述方法中，若堆体高度高于1.3m，则于堆肥的第3天开始向堆体中通入空气，通气量为每小时堆体体积的10~20%，如10%或20%。若堆体高度在1.3m以下则不需另行向堆体中通入空气。
`[0051]在本发明中，以上所有的所述热纤梭菌(Clostridium thermocellum)为热纤梭菌(Clostridium thermocellum) ACCC00165 ；
[0052]所述嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus thermophilus)为嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus thermophilus) ACCC10253 ；
[0053]所述台湾假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas taiwanensis)为在CGMCC编号为
1.10867的菌株；
[0054]所述土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)为在CGMCC编号为1.3103的菌株；
[0055]所述地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)为在CGMCC编号为1.813的菌株。
[0056]在本发明中，作为辅料的所述秸杆粉或所述谷壳粉的粒径为0.1~5mm，如0.1~1mm或Imm~5mm,具体如Imnin
[0057]本发明所提供的复合菌剂由良好共生的细菌组成，在微好氧共培养条件下，可按比例有规律的增殖，高效分解木质纤维素。菌剂制造过程因共培养，其制造过程简单，分解功能稳定，保质期长。使用该菌剂发酵堆肥，因需微好氧条件，无需大量通气、而节省能源，减少氮素损失；显著提前木质纤维素的分解而提前完全腐熟，提高肥料质量。
【专利附图】
【附图说明】
[0058]图1为实施例2中菌剂组和对照组的温度随堆制时间的变化曲线。[0059]图2为实施例3中菌剂组和对照组的温度随堆制时间的变化曲线。
[0060]图3为实施例4中菌剂组和对照组的温度随堆制时间的变化曲线。
[0061]图4为实施例5中菌剂组和对照组的温度随堆制时间的变化曲线。
[0062]图5为实施例6中菌剂组和对照组的温度随堆制时间的变化曲线。
[0063]图6为实施例7中菌剂组和对照组的温度随堆制时间的变化曲线。
[0064]图7为实施例8中菌剂组和对照组的温度随堆制时间的变化曲线。
【具体实施方式】
[0065]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0066]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0067]实施例1、菌剂的制备
[0068]一、实验材料
[0069]1、制备菌剂所有菌株
[0070]I 号菌:热纤梭菌(Clostridium thermocellum) ACCC00165 (ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号:00165)；
[0071]2 号菌:嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus thermophilus) ACCC10253 (ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号:10253)；
[0072]3 号菌:台湾假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas taiwanensis) CGMCC Nol.10867(CGMCC中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种目录编号:1.10867)；
[0073]4 号菌:土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri) CGMCC Nol.3103 (CGMCC 中国普通微生物囷种保减管理中心，囷种目录编号:1.3103)；
[0074]5 号菌:地衣芽孢杆菌(Bacillus lichen if ormis)CGMCC Nol.813 (CGMCC 中国普通微生物菌种保藏管理中心,菌种目录编号:1.813)。
[0075]2、培养基
[0076]PCSl培养基:溶剂为水，溶质及浓度具体如下:蛋白胨5g/L、酵母粉lg/L、氯化钠5g/L、碳酸钙3g/L、滤纸或稻杆10g/L,pH6.5~8.5。其中，所述稻杆为玉米稻杆(也可用水稻稻杆或小麦稻杆替代)，其粒径为0.1~5mm。
[0077]所述培养基成分中蛋白胨、酵母粉、氯化钠、碳酸钙均由“北京双旋微生物培养基制品厂购买，地址:北京市海淀区正红旗东街甲39号邮编:100091”。
[0078]二、实验方法及结果
[0079]1、菌株混合培养时间的确定
[0080]在无菌条件下，用PCSl培养基分别活化培养5种菌(I号菌-5号菌)，至各菌株的浓度为5X 109cfu/ml时，每种菌各取Iml混合，将5ml混合菌液接种到装有400ml PClS培养基的500ml三角瓶中，55°C静止培养，每隔24小时经细菌指纹基因定量PCR(具体方法见下文)分析确定培养体系中5种菌的比例关系。
[0081]结果如表1所示，可见，第72小时为菌总量与主要分解菌(I号菌)量最多时期，因此，选择培养第72小时作为制作菌剂的最佳时期。
[0082]本发明的发明人将被确定为制作菌剂的最佳时期(第72小时)的混合培养液转接，连续2年的培养也不改变菌种组成和比例。[0083]表1 55°C静止培养5种菌的比例关系
[0084]
【权利要求】
1.一种堆肥菌剂，其活性成分为热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus thermophilus)、台湾假黄单胞菌(Pseudoxanthomonastaiwanensis)、土壤短芽抱杆菌(Brevibacillus agri)和地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)； 所述热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、所述嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillusthermophilus)、所述台湾假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas taiwanensis)、所述土壤短芽抱杆菌(Brevibacillus agri)和所述地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)的 CFU 配比为(3 ~5): (1 ~2): (1 ~2): (1 ~2): (1 ~2)。
2.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于:所述菌剂还包括辅料，所述辅料为如下(a)或(b): Ca)由秸杆粉和碳酸钙按照质量比为(8~9): (1~2)的比例混合而成； (b)由谷壳粉和碳酸钙粉按照质量比为(8~9): (1~2)的比例混合而成。
3.根据权利要求1或2所述的菌剂，其特征在于:在所述菌剂中，作为活性成分的所述热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、所述嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillusthermophilus)、所述台湾假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas taiwanensis)、所述土壤短芽抱杆菌(Brevibacillus agri)和所述地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)的总量为(5X IO8 ~5X IO10) cfu/g 所述菌剂。
4.权利要求1-3中任一所述的菌剂的制备方法，包括如下步骤: (O培养作为所述活性成分的各菌株； (2)按照如下al) _a3)的条件将作为所述活性成分的各菌株和所述辅料混合，得到所述菌剂: al)在所述菌剂中，作为所述活性成分的所述热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、所述嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus thermophilus)、所述台湾假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas taiwanensis)、所述土壤短芽抱杆菌(Brevibacillus agri)和所述地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)的 CFU 配比为(3 ~5): (I ~2): (I ~2): (I ~2):(1 ~2); a2)为如下 a2_l)或 a2_2): a2-l)在所述菌剂中，作为所述辅料的所述秸杆粉和碳酸钙的质量比为(8~9):(1~2)； a2-2)在所述菌剂中，作为所述辅料的所述稻壳粉和碳酸钙的质量比为(8~9):(1~2)； a3)在所述菌剂中，作为活性成分的所述热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、所述嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus thermophilus)、所述台湾假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas taiwanensis)、所述土壤短芽抱杆菌(Brevibacillus agri)和所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的总量为(5X IO8~5X 101°) cfu/g所述菌剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，对作为所述活性成分的各菌株进行培养的培养基为PCSl培养基或PCS2培养基； 所述PCSl培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下:蛋白胨5g/L、酵母粉lg/L、氯化钠5g/L、碳酸韩3g/L、滤纸或稻杆10g/L ；所述PCS2培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下:玉米蛋白5g/L、酵母粉lg/L、氯化钠5g/L、碳酸钙lg/L、滤纸或稻杆10g/L。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，对作为所述活性成分的各菌株进行培养的条件为--温度50~60°C，静止培养，控制发酵液溶氧量为0.1-0.5mg/L,时间48h~72h。
7.利用权利要求1-3中任一所述的菌剂堆制堆肥的方法，包括如下步骤: (O将所述菌剂和堆肥原料按照质量配比为(0.2~0.5):100的比例混合，得到混合物； (2)用步骤(1)所得混合物堆制堆肥，堆制当天记为第I天，根据第3天的堆体温度按照如下进行翻堆:若第3天的所述堆体温度高于50°C，则自第3天起每天翻堆一次，至第12天；若第3天的所述堆体温度为50°C以下，则自第3天起隔天翻堆一次至第12天； (3)自第13天起，每3天翻堆一次，当所述堆体温度降至40°C以下并不再升高时，停止翻堆；将堆体放置至堆体中碳元素和氮元素的质量比小于20时，堆制结束。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:在所述方法中，若堆体高度高于1.3m，则于堆制的第3天开始向堆体中通入空气，通气量为每小时堆体体积的10~20%。
9.根据权利要求1-8中任一所述的菌剂或方法，其特征在于:所述热纤梭菌(Clostridium thermocellum)为热纤梭菌(Clostridium thermocellum) ACCC00165 ;或 所述嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus thermophilus)为嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus thermophilus)ACCC10253 ;或 所述台湾假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas taiwanensis)为在CGMCC编号为1.10867的菌株；或 所述土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)为在CGMCC编号为1.3103的菌株；或 所述地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)为在CGMCC编号为1.813的菌株。
10.根据权利要求1-9中任一所述的菌剂或方法，其特征在于:所述秸杆粉或所述谷壳粉的粒径为0.l-5mm。
【文档编号】C12R1/10GK103614326SQ201310614216
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】崔宗均, 袁旭峰, 袁维强, 王小奎 申请人:峨眉山绿地生态农业开发有限公司