一种有机废弃物的耐高温腐熟菌剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵、废弃物资源化利用领域，特别涉及一种可以快速腐熟有 机废弃物的耐高温腐熟菌剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 有机废弃物包括作物秸杆、畜禽粪便、城市生活垃圾、污泥等。我国为农业大国，农 业废弃物及畜禽粪便年产量达40亿吨以上，而城市生活垃圾年产量也达到了 2.5亿吨以上， 如此巨大的可再生资源，并未得到充分的利用。
[0003] 目前，高温好氧堆肥逐渐成为处理有机废弃物的重要途径，可实现无害化、减量化 和资源化。国内外学者针对堆肥腐熟菌剂开展了大量工作，并取得了丰厚的成果，但高温环 境对腐熟菌剂的影响依旧值得深入探讨，堆肥化中有机废弃物主要降解过程在堆肥高温 期，而高温环境抑制了大部分常温微生物，CN 102010824、CN 1772880等公布了多种由枯草 芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、酵母菌、小孢链霉菌、康宁木霉等微生物构成的复合微生物菌剂， 但这些微生物活性在高温环境下会受到明显的抑制，大幅降低微生物活性，减缓腐熟进程， CN 102851246公布了嗜热栖热菌在堆肥中的应用，栖热菌具有较好的温度适应性，但其生 物量仅有1〇4~l〇 6cfu/g，发酵周期长，产酶活性相对较低，不适合大规模推广。
[0004] 在有机废弃物堆肥中接种耐高温菌剂，可有效提高有机质分解速率，缩短发酵周 期，提高堆肥制品的质量。目前有机物料腐熟剂采用耐高温芽孢杆菌的报道并不多见。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了解决现有腐熟剂在有机废弃物处理中的应用缺陷，针对其升 温慢、温度不稳定、微生物活性低及发酵周期长等问题，提供一种能耐受高温环境，且生物 酶活性好的有机废弃物的腐熟菌剂。
[0006] 本发明的另一目的是提供上述耐高温腐熟菌剂的应用。
[0007] -种腐熟有机废弃物的耐高温腐熟菌剂，其特征在于：命名为：枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)Hl-7,保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC N0: M2015174。
[0008] 进一步地，所述H1-7菌剂，在55°C的环境中生长良好，55°C时的α-淀粉酶活可达 62. lU/mL，蛋白酶活为673.2U/mL，纤维素酶活为6.75U/mL。
[0009] 上述菌剂在有机废弃物堆肥中的应用。
[0010] 进一步地，应用方法如下：将所述H1-7菌剂的发酵液和市售有机废腐熟剂按1:10 ~20的质量比混合，以0.2%~0.5%的接种量接入有机废弃物堆体发酵，可加快有机废弃 物腐熟。
[0011]进一步地，所述H1-7菌剂发酵液的培养为:将H1-7菌株保藏斜面进行活化，挑取单 菌落接入LB液体培养基，37°C恒温培养8-12h，种子液接入发酵培养基，起始pH 6.5~8.0， 装液量10~50mL，接种量0.1~5%，置于20~45°C恒温培养，转速100~240r/min，发酵24~ 48h〇
[0012] 进一步地，所述的发酵培养基为：葡萄糖1~25g/L，豆柏10~50g/L，K2HP〇4 0.1~ 2.5g/L，MgS〇4 0.1~2.0g/L。
[0013] 进一步地，所述市售有机废弃物腐熟剂，含有黑曲霉孢子107个/g，解淀粉芽孢杆 菌108CFU/g。
[0014] 本发明提供的有机废弃物的耐高温腐熟菌剂，针对堆肥高温期温度大于55°C的特 点，筛选能耐受55°C以上高温的芽孢杆菌，具有更好的微生物代谢活性，良好的产酶特性， 有利于有机废弃物的分解。与现有有机废弃物微生物处理技术相比，本发明的有益效果表 现在：1、通过堆肥初期接种耐高温菌剂，快速提高堆体温度，耐高温菌剂能在高温环境下能 够维持较好的降解效果，具有更强的环境适应性，加速了堆肥化进程;2、本菌剂微生物构成 简单，制备方便，利于推广。
【附图说明】
[0015] 图1为本发明实施例提供的B.subtilis H1-7菌株16S rDNA序列分析。
[0016] 图2为本发明实施例提供的堆肥过程中不同处理温度的变化。（注:CK:不接种微生 物菌剂;T1:接种市售腐熟剂;T2:接种市售腐熟剂+耐高温腐熟剂。）
[0017] 图3为本发明实施例提供的堆肥过程中不同处理微生物的变化。（注:实心图标为 常温细菌(37°C培养），空心图标为高温细菌(55°C培养)）
[0018] 图4为本发明实施例提供的堆肥过程中不同处理有机质的变化。
[0019] 图5为本发明实施例提供的堆肥过程中不同处理种子发芽率的变化。
【具体实施方式】
[0020] 现结合实施例对本发明进行详细的说明。
[0021 ]实施例1:本发明实施例提供的耐高温芽孢杆菌H1-7的筛选及鉴定
[0022]从自然堆肥及活性污泥中取样，利用梯度稀释涂布法分离微生物。将稀释涂布平 板放置55°C培养箱恒温培养24h。挑选长势较快菌株分离纯化。用接种针将分离纯化菌株点 接至淀粉平板、蛋白平板和纤维素刚果红平板上。培养24h后观察透明圈。通过测定透明圈 与菌落直径比（见表1)进行初筛，初筛后进行液体产酶发酵复筛，从堆肥中获得8株降解淀 粉、蛋白、纤维素效果较好的细菌(见表2)，其中H1-7菌株在55°C的环境下，产酶性能明显优 于其他菌株，α-淀粉酶活可达62. lU/mL，蛋白酶活为673.2U/mL，纤维素酶活为6.75U/mL，对 有机废弃物具有良好降解活性。
[0023]表1有机废弃物降解菌的筛选
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[0026] 表2各菌株生物酶活(培养温度:37°C)
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[0028] H1-7为从土壤、自然堆肥及活性污泥中筛选所得，其温度耐受性好(在60°C的环境 下可正常生长），且在55°C条件下对淀粉、蛋白质及纤维素有较强的分解能力；筛选到的H1-7菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，产芽孢，在LB平板上正反面均为白色，表面光滑，不透明，粘 稠、挑之拉丝、圆形突起的菌落形态;序列见序列表1。
[0029] 通过对H1-7菌株的16S rDNA序列分析，在GenBank核苷酸序列数据库中进行Blast 比对搜索，选择与H1-7同源性较高的序列进行系统发育学分析，结果如图1所示。依据以上 结果可以认为H1-7菌株为芽孢杆菌属，H1-7与枯草芽孢杆菌是同一种群菌株，并于2015年3 月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC N0:M2015174,保藏单位地址： 湖北省武汉市武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路299号）。
[0030] H1-7菌株液体菌剂的培养:将H1-7菌株保藏斜面进行活化，挑取单菌落接入LB液 体培养基，37°C恒温培养8-12h，种子液接入发酵培养基:葡萄糖1~25g/L，豆柏10~50g/L， K2HPO4 0.1~2.5g/L，MgS〇4 0.1~2.0g/L，起始pH 6.5~8.0，装液量10~5〇111以25〇11^锥形 瓶），接种量〇. 1~5 %，置于20~45°C恒温培养，转速100~240r/min，发酵24~48h，得到H1-7菌剂的发酵液。所得H1-7的发酵液芽孢总数可达80 X 108CFU/mL以上。
[0031] 下面结合耐高温菌H1-7在有机废弃物堆肥中的应用实施例对本发明进一步详细 说明。
[0032] 实施例2本发明实施例提供的耐高温菌H1-7在餐厨垃圾秸杆混合堆肥中的应用 [0033] 1、餐厨垃圾秸杆混合堆肥腐熟过程
[0034]将餐厨垃圾与秸杆(玉米秸杆、稻杆)按照湿基质比5:1进行混合，或根据物料理化 性质调整C/N比例，使混合物