一种有机物料腐熟剂的制备方法
【专利摘要】本发明涉及农业微生物菌剂制备工艺【技术领域】，特别涉及一种有机物料腐熟剂的制备方法，包括如下步骤：（1）菌种选育选择及其安全性鉴定；（2）种子液制备，包括培养基制备、种子液制备、二级种子液制备和沤堆发酵种子液制备；（3）堆沤发酵，包括堆沤发酵培养基配方及其发酵条件设置；（4）堆制产品干燥、粉化、计量、包装，即制成有机物料腐熟剂。本发明的生产成本低廉、工艺简洁成熟、方便使用、腐熟应用效果显著，有利于普遍推广和应用。
【专利说明】一种有机物料腐熟剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种有机物料腐熟剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]现有技术中，有机物料腐熟剂的核心微生物一般按照微生物分类水平的差异进行液体或固体发酵，然后将其菌剂的制品按照一定配比进行混合、载体吸附、干燥等工艺。
[0003]目前，多数腐熟剂产品通过对复合菌种的扩大培养，通过混合发酵或者经单一发酵过后充分混合简单混合后即为一种有机物料腐熟剂的新产品，而未涉及到有机物料腐熟剂的评价指标中涉及的执行标准、质量监督、田间示范推广等商业性范畴，缺乏有机物料腐熟剂在批量生产、推广、使用等方面的探索，其专利产品在进程中的潜力未做描述。其缺点是，腐熟剂产品追求功能性菌种的数量，而未对其发酵水平和酶活力进行评价，造成生产发酵工艺繁琐、生产周期长、活菌数及酶活力水平不确定；制品未严格执行农业部制定的相关标准；在使用方法上，没有在不同地区、不同气候、土壤环境下对多种作物秸杆直接还田模式下的功能设置田间试验进行验证。
[0004]中国专利申请号为201010615828.X的发明专利，公开了一种秸杆腐熟剂，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌杆菌、康氏木霉、黄孢原毛平革菌和嗜热侧孢霉。然而该对比文件仅将五种菌简单混合制成腐熟剂，在实际生产中，生产工艺复杂、效率低下、生产成本高、对其制备的产品的性能指标未作评价，在其进一步进程中，存在潜在的不确定因素，且腐熟对象及使用环境不具备广 谱性，制得的腐熟剂使用效果较差。
[0005]然而，现有技术中，通过堆怄的方式对秸杆腐熟剂的功能性菌种进行繁殖培养，制备出一种原材料来源广泛、价格低廉、生产工艺简洁、活菌数量多、酶活力旺盛且具有广谱性应用效果的商品有机物料腐熟剂，尚未报道。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于针对现有腐熟菌剂技术生产成本高昂、制备工艺复杂、使用方法繁琐、应用效果不稳定等问题，提出一种成本低廉、工艺简洁、方便使用、效果显著的有机物料腐熟剂的制备方法。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案实现的。
[0008]一种有机物料腐熟剂的制备方法，它包括以下步骤:
[0009](I)菌种选育
[0010]Al、选菌种:选取枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)、侧抱芽抱杆菌(Bacillus laterosporus)、康氏木霉菌(Trichodermakoningii)、黄抱原毛平革菌(Phanerochete chrysosporium)、嗜热侧抱霉菌(Sporotrichum thermophile)、嗜冷芽抱八叠球菌(Sporosarcina psychropilus)、热纤维梭菌(Clostridium thermocecrllum)中五种或五种以上的菌种组成一组菌种组合。其中，侧孢芽孢杆菌的保藏单位名称是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址是北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2006年7 月 13 日，保藏编号是 CGMCC N0.1755，分类命名是 Bacillus laterosporus。
[0011]
【权利要求】
1.一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤: (1)菌种选育 Al、选菌种:选取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌、嗜热侧孢霉菌、侧孢芽孢杆菌、热纤维梭菌和嗜冷芽孢八叠球菌中的五种或五种以上的菌种组成一组菌种组合； A2、菌种生物安全性鉴定:根据微生物肥料生物安全通用技术对上述菌种组合中的各个菌种分别进行安全性鉴定，去除有毒不安全的菌株； (2)种子液制备 B1、斜面培养 Bll、菌种组合中各个菌种的斜面培养基制备 B12、斜面培养条件 将上述斜面培养的各个菌种分别用5~IOml无菌水稀释后，在茄子瓶中，分别接种于斜面培养基中，培养条件为:培养温度为25~50°C，培养时间为24~96h ； B2、种子液制备 B21、一级种子液制备:将上述各个茄瓶中斜面培养的菌种用无菌水冲洗，制备成均匀的菌悬液；调节每种细菌的活菌数为10~120亿cfu/ml，真菌的活菌数为0.5~3亿cfu/ml ;分别储存于无菌钢制容器中，备用； B22、二级种子液制备:将B21步骤得到的一级种子液分别接种于经121°C灭菌120min的专用固体培养基中进行单个菌种发酵，接种2-7天后采用平板计数法测定活菌数并用无菌水调节目标菌种的活菌数，制备成菌种单一的均匀菌悬液；制得二级种子液，备用； B23、怄堆发酵种子液制备 将各个菌种的二级种子液根据不同菌种组合，按任意重量比配制成怄堆发酵种子液，怄堆发酵种子液中活菌总数为5-20亿/ml ； (3)堆怄发酵 Cl、堆怄发酵培养基 包括以下重量百分比的原料:木屑30~35%、稻草粉10~20%、谷壳15~25%、麸皮20~25%、蔗糖0.5~1%、硫酸铵3~5%、磷酸氢二钾0.3~0.5%、七水硫酸镁0.1~0.3%，自然pH值，水料重量比为1:1~4:1 ; C2、堆怄方法及初始培养条件 将上述堆怄发酵培养基按比例充分混合均匀，直接将配制好的怄堆发酵种子液喷洒到堆料表面；怄堆发酵种子液与堆怄发酵培养基均匀混合；将接种后的物料放到发酵室进行发酵； (4)堆制产品干燥、粉化、计量、包装 堆体干燥温度为40~60°C，至堆体含水量为6~10%，将堆料粉碎，过2mm筛，检测后备用，其有效活菌数为2.3~23亿/g，纤维素酶活为300~1000U/g，蛋白质酶活为35~.200 U/g，水份为2~30%，pH为5.5~7.5，细度70~100% ;利用包装设备进行计量、封包，即制成的有机物料腐熟剂。
2.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于:所述步骤B12、培养条件，具体为:枯草芽孢杆菌的培养温度为30~40°C，培养时间为24~48h ； 地衣芽孢杆菌的培养温度为30~40°C，培养时间为24~48h ； 康氏木霉菌的培养温度为25~32°C，培养时间为72~96h ； 黄孢原毛平革菌的培养温度为35~42°C，培养时间为72~96h ； 嗜热侧孢霉菌的培养温度为38~50°C，培养时间为72~96h ； 侧孢芽孢杆菌的培养温度为28~35°C，培养时间为24~48h ； 嗜冷芽孢八叠球菌的培养温度为20~30°C，培养时间为24~48h ； 热纤维梭菌的培养温度为30~37°C，培养时间为24~48h。
3.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于:所述步骤Al、选菌种:菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉和热纤维梭菌； 所述步骤B23中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、嗜热侧孢霉和热纤维梭菌五种菌按照均等重量比配制怄堆发酵种子液。
4.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于:所述步骤Al、选菌种:菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、黄孢原毛平革菌； 所述步骤B23中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木霉菌、黄孢原毛平革菌和嗜热侧孢霉菌五种菌的怄堆发酵种子液的重量比的比例为2.0~2.5:2.0~2.5:1.0~2.0:2.0 ~3.0:2.0 ~3.0。
5.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于:所述步骤Al、选菌种:菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、黄孢原毛平革菌和侧孢芽孢杆菌； 所述步骤B23中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、黄孢原毛平革菌和侧孢芽孢杆菌六种菌按照均等重量比配制怄堆发酵种子液。
6.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于:所述步骤Al、选菌种:菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、侧孢芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、热纤维梭菌； 所述步骤B23中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、侧孢芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、热纤维梭菌七种菌按照均等重量比配制怄堆发酵种子液。
7.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于:所述步骤Al、选菌种:菌种组合为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、侧孢芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、热纤维梭菌、嗜冷芽孢八叠球菌； 所述步骤B23中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、康氏木莓、嗜热侧孢霉、侧孢芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、热纤维梭菌、嗜冷芽孢八叠球菌八种菌按照均等重量比配制怄堆发酵种子液。
8.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于:所述步骤Bll中，菌种组合中各个菌种的斜面培养基配方及制备方法为: 枯草芽孢杆菌斜面培养基一牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性,灭菌； 地衣芽孢杆菌斜面培养基一牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性,灭菌； 康氏木霉菌斜面培养基一草粉60~80g/L，硫酸铵25~35 g/L，磷酸二氢钾4~8g/L，硫酸镁I~2 8/1，氯化钙0.1~0.3 g/L，调节pH为6~7，加入琼脂15g/L，60~100°C加热熔化，倒入磁盘，冷却后切割成条，放入茄子瓶，灭菌； 黄孢原毛平革菌斜面培养基一麦麸120~140g/L煮沸后用纱布过滤、蔗糖10~15g/L、pH自然，加入琼脂20g/L，灭菌； 嗜热侧孢霉菌斜面培养基一去皮马铃薯200g/L切成小块煮沸15~20min，用四层纱布过滤，加鹿糖20g/L、pH自然、加入琼脂20g/L,灭菌； 侧孢芽孢杆菌斜面培养基一牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性,灭菌； 嗜冷芽孢八叠球菌斜面培养基一牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌； 热纤维梭菌斜面培养基:牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、调节pH至中性，灭菌。
9.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于:所述步骤B22、二级种子液制备中， 枯草芽孢杆菌二级种子液制备:固体发酵培养基包括以下重量份的原料:麦麸150~170份、谷壳40~60份、玉米粉30~50份、豆柏20~30份、蔗糖I~3份、磷酸二氢钾0.5~1.5份、七水硫酸镁.0.5~1.5份、硫酸锰0.01~0.1份、石灰粉4~6份、水290~300份；分装后灭菌，121°C灭菌120分钟，冷却至常温，将上述枯草芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2~3天后，采用平板计数法测定发酵产物中的活菌数并用无菌水调节活菌数为80~120亿cfu/ml的液体种子液，备用； 地衣芽孢杆菌二级种子液制备:固体发酵培养基包括以下重量份的原料:豆柏15~20份、玉米粉40~55份、麦鉄200~240份、酵母粉4~6份、憐酸二氢钾0.5~1.5份、七水硫酸镁0.5~1.5份、硫酸锰0.05~0.15份、碳酸钙12~16份、石灰粉5~6份、水295~300份；分装后灭菌，121°C灭菌120分钟，冷却至常温，将上述地衣芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2~3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为80~120亿cfu/ml的液体种子液，备用； 康氏木霉菌二级种子液制备:固体发酵培养基包括以下重量份的原料:谷壳100~120份、麦麸60~80份、硫酸铵4~6份、磷酸氢二钾I~2份、七水硫酸镁0.1~0.5份、无水氯化钙0.1~0.5份，水200~230份；分装后灭菌，121°C灭菌120分钟，冷却至常温，将上述康氏木霉菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5~6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为0.5~3亿cfu/ml的液体种子液，备用； 黄孢原毛平革菌二级种子液制备:固体发酵培养基包括以下重量份的原料:木屑200~300份、谷壳400~600份、麦麸100~200份、硫酸铵10~20份、磷酸氢二钾5~10份、七水硫酸镁0.5~1份、无水氯化钙0.5~1份、水200~250份；分装后灭菌，121°C灭菌120分钟，冷却至常温，将上述黄孢原毛平革菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5~6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为05~3亿cfu/ml的液体种子液，备用；嗜热侧孢霉菌二级种子液制备:固体发酵培养基包括以下重量份的原料:谷壳150~180份、麦麸20~40份、硫酸铵3~5份、磷酸氢二钾1~2份、七水硫酸镁0.1~0.2份、无水氯化钙0.1~0.3份、水200~240份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述嗜热侧孢霉菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种5~6天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为0.5~3亿cfu/ml的液体种子液，备用； 侧孢芽孢杆菌二级种子液制备:固体发酵培养基包括以下重量份的原料:麦麸400~600份、玉米粉100~200份、豆柏60~100份、蔗糖5~10份、谷壳粉50~80份、磷酸氢二钾3~10份、七水硫酸镁1-5份、石灰30-50份，水800-1000份，分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将侧孢芽孢杆菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2~3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为80~120亿cfu/ml的液体种子液，备用； 嗜冷芽孢八叠球菌二级种子液制备:固体发酵培养基包括以下重量份的原料:麸皮700~800份、谷壳50^100份、玉米粉10~50份、豆柏10~50份、硫酸镁0.5~1.0份、硫酸锰0.1-0.5份，石灰40~60份，水1000~1100份，分装后灭菌，121 ℃灭菌120分钟，冷却至常温，将嗜冷芽孢八叠球菌一级种子液进行接种，浅盘发酵；接种2~3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为80~120亿cfu/ml的液体种子液，备用； 热纤维梭菌二级种子液制备:固体发酵培养基包括以下重量份的原料:豆柏15~20份、玉米粉40~55份、麦鉄200~240份、酵母粉4~6份、憐酸二氢钾0.5~1.5份、七水硫酸镁0.5~1.5份、硫酸锰0.05~0.15份、碳酸钙12~16份、石灰粉5~6份、水295~300份；分装后灭菌，121℃灭菌120分钟，冷却至常温，将上述热纤维梭菌一级种子液进行接种，装入密封袋，厌氧发酵；接种2~3天后，测定发酵产物中的活菌数、用无菌水调节活菌数为1~20亿cfu/ml的液体种子液，备用。
10.根据权利要求1所述的一种有机物料腐熟剂的制备方法，其特征在于:所述堆怄发酵中步骤C2之后，还包括有步骤C3、设置初始发酵条件: 含水量:调节初始含水量为50~60%，含种子液； 初始pH值:自然pH值； 初始温度:自然温度； 接种量:怄堆发酵种子液总重量控制在发酵培养基总重量的5-10% ； 翻堆:将接种好的物料呈堆状放置，堆体的温度上升到60~80℃时，进行翻堆降温，发酵第3天，第一次翻堆；第4、5、6、7天每隔24小时翻堆一次，第8~12天，每隔48~72小时翻堆一次，使堆体温度保持在25~50℃ ； 通气量:通过打孔的方式调节堆体通气量，在堆体升温期及高温期间，温度> 35℃，通入0.4~0.6 MPa的高压空气，通气量为每6~12小时通气每次10~20min ;堆体降温期间，温度≤30℃，通入0.4~0.6 MPa的高压空气，通气量为每24~36小时通气5~10分钟； 培养时间:7~12天。
【文档编号】C12R1/145GK103898008SQ201410068629
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2013年6月8日
【发明者】张新雄, 王亚君, 毛光平, 张东升 申请人:东莞市保得生物工程有限公司