一种利用趾甲提取dna扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，含以下步骤：（1）选取三线闭壳龟的趾甲，预处理后，用MicroElute?Genomic?DNA?Kit试剂盒提取三线闭壳龟DNA；（2）设计能覆盖三线闭壳龟线粒体全基因组的16对引物，以步骤（1）中提取获得的三线闭壳龟DNA为模板，利用16对引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序和拼接后，首次扩增获得三线闭壳龟线粒体全长。该方法步骤简洁，成本低，属于非损伤性取样，能获得三线闭壳龟线粒体全序列。
【专利说明】一种利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于三线闭壳龟【技术领域】，具体涉及一种利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法。
【背景技术】
[0002]龟鳖类是较古老且形态最为特化的一支爬行动物，在地球上出现的最早记录是晚三叠纪，距今已有约2.2亿年的历史，被称为“活化石”。近几十年来，全世界由于非法捕杀和栖息地丧失而处境危险的龟鳖种类越来越多，绝大部分已被列入濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)附录中。特别是在亚洲，作为食物、传统药物和宠物贸易的受害者，多数龟鳖成员在野外几乎已绝迹，引发了国际关注的亚洲龟类危机(Asian Turtle Crisis)现象。2011年，国际生物保护学会(WCS)和龟生存联盟(TCC)共同发布了一个“Turtles inTrouble”的专题，旨在引起全世界对龟鳖类生存现状的重视。报道指出如果没有强有力的保护措施，更多的淡水龟和海龟物种将在未来的十年里灭绝。
[0003]目前，关于龟鳖动物的研究主要集中在种质资源调查、形态学观察、增养殖研究以及进化和系统学关系等方面。涉及分子遗传、功能基因、物种鉴定和家系选育等分子生物学方面的研究比较少，远不及哺乳动物、两栖类、鸟类甚至鱼类研究的深入。造成这种状况的主要也是重要原因之一，就是研究样本特别是取样方式的限制。鉴于目前龟鳖的生存状态，龟鳖分子生物学研究的样本取样方式值得人们关注。 [0004]三线闭壳龟(Cuora trifasciata)又名金钱龟,是样本珍贵、极度漸危的物种,被世界自然保护联盟(IUCN)列为极度濒危物种并被收录于濒危物种贸易公约(CITES)的附录II中。2006年以来，学术界关于三线闭壳龟(金钱龟)种的界定以及其与闭壳龟属其它成员之间的系统进化关系都一直存在争论。但由于非损伤性取样提取DNA的问题一直没有得到解决，因此对其的相关研究一直处于初级阶段，甚至三线闭壳龟的线粒体全序列至今没有报道。
[0005]目前，三线闭壳龟常用的取样方法有三种，即伤害性取样(destructivesampling)、非伤害性取样(nondestructive sampling)和非损伤性取样(noninvasivesampling)。对于一些样本珍贵、极度濒危甚至受法律保护的物种、需要大规模取样的研究或者长期跟踪的群体实验，非伤害性及非损伤性取样提取DNA用于后续的实验研究，则显得尤为重要。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，该方法步骤简洁，成本低，属于非损伤性取样，能获得三线闭壳龟线粒体全序列。
[0007]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:一种利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，含以下步骤:
[0008](I)选取三线闭壳龟的趾甲，预处理后,用MicroElute Genomic DNA Kit试剂盒提取三线闭壳龟DNA ；
[0009](2)设计能覆盖三线闭壳龟线粒体全基因组的16对引物，以步骤(1)中提取获得的三线闭壳龟DNA为模板，利用16对引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序和拼接后，首次扩增获得三线闭壳龟线粒体全长。
[0010]在上述步骤中:
[0011]本发明步骤(1)中所述的预处理包括采用无水乙醇浸泡三线闭壳龟的趾甲以及用
IXPBS缓冲液浸泡步骤。
[0012]本发明步骤(1)中用MicroElute Genomic DNA Kit试剂盒提取三线闭壳龟DNA时，MicroElute Genomic DNA Kit试剂盒中TL Buffer初始加入量优选为210~220 μ L ;消化时采用摇床气浴，温度优选为56~60°C,转速优选为60~70rpm/min,时间优选为3~5小时；洗脱液优选为无菌蒸馏水25~50 μ L，重复洗脱2次。
[0013]本发明步骤(1)中用MicroElute Genomic DNA Kit试剂盒提取三线闭壳龟DNA时，TL Buffer初始加入量较好为220 μ L，消化时采用摇床气浴，温度较好为56°C，转速较好为60rpm/min,时间较好为3~5小时,洗脱液较好为无菌蒸懼水25~50 μ L,重复洗脱2次。
[0014]本发明步骤(2)中所述的16对引物由以下序列所示的引物组成:SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7 和SEQ ID N0.8,SEQ ID N0. 9和 SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.11 和 SEQ ID N0.12,SEQ ID N0.13和 SEQ ID N0.14,SEQ ID N0.15 和 SEQ ID N0.16,SEQ ID N0.17 和 SEQ ID N0.18,SEQ IDN0.19 和 SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.21和 SEQ ID N0.22、SEQ ID N0.23 和 SEQ ID N0.24、SEQ ID N0.25 和 SEQ ID N0.26、SEQ ID N0.27 和 SEQ ID N0.28、SEQ ID N0.29 和 SEQ IDN0.30、SEQ ID N0.31 和 SEQ ID N0.32。
[0015]本发明步骤(2)中PCR扩增时PCR反应体系包括浓度为2.5mM的dNTP2.4yL，三线闭壳龟模板DNAl μ L，浓度为10 μ mol的引物各0.5 μ L，Taq聚合酶0.5 μ L，10 XBuffer4 μ L,加水至 40 μ L。
[0016]本发明步骤(2)中PCR扩增时PCR反应条件为:95°C变性2min后，进行30个循环，每个循环的程序为:95°C变性30s，52°C~60°C退火30s，72°C延伸30s，最后72°C继续延伸IOmin0
[0017]本发明步骤(2)中获得的三线闭壳龟线粒体全长为16675bp，其核苷酸序列如SEQID N0.33 所示。
[0018]本发明以三线闭壳龟(Cuora trifasciata)为对象,探讨了采集趾甲样本提取DNA作为分子生物学研究的可行性，并以趾甲提取的DNA为模板，首次扩增获得了三线闭壳龟完整线粒体基因组全序列，为三线闭壳龟的物种管理和保育研究以及其它龟鳖动物的相关研究和保护提供借鉴。
[0019]与现有技术相比，本发明具有如下优点:
[0020](I)不受样本限制，活体和标本DNA含量都相对较高，可以满足实验需求；
[0021](2)对标本外观影响不大，对动物个体无伤害或者伤害轻微，属于非伤害性取样或者非损伤性取样(半年内，所采集的240只个体无一例死亡)；
[0022](3)保存运输简单，运输时间相对较长；[0023](4)提取方法简单，可使用试剂盒大批量的提取群体样本DNA ；
[0024](5)提取获得的DNA，可以扩增线粒体全序列；
[0025](6)可修复性强、可再生、可多次取样，对试验样本珍贵或需要大量群体样本的采集实验来说，可以大量节约成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1是实施例1中趾甲DNA提取的电泳结果，N1-N8分别对应表2中的样本编号；
[0027]图2是实施例1中DNA样本梯度稀释TF片段PCR扩增结果，其中M为DL2000 (Takara) 1-6 为 N7 稀释 20、50、100、150、200 倍，7-12 为 N3 稀释 20、50、100、150、200倍，13-18 为 N8 稀释 20、50、100、150、200 倍。
【具体实施方式】
[0028]实施例1
[0029]本实施例提供的利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，含以下步骤:
[0030](I)趾甲取样
[0031]用手术剪剪取三线闭壳龟的趾甲，无水乙醇浸泡保存于-20°C，待用；
[0032](2)基因组DNA的`提取
[0033]提取DNA前，趾甲用I X PBS缓冲液4 V浸泡过夜，期间换洗2~3次。取样本趾甲各约 10 ~20mg，用 MicroElute Genomic DNA Kit (OMEGA，USA)试剂盒提取 DNA，①将趾甲样本加入到1.5mL离心管中，加入210~220 μ L的TLBuffer ;②将趾甲样本尽量剪碎，加入20 μ L的OB溶液；③置于温度为转速为60~70rpm/min的摇床气浴，56~60°C消化3~5小时；@ 20，OOOxg离心2min，取上清；⑤加入220 μ L的BL Buffer，混合后70°C水浴IOmin ;⑥加入220 μ L无水乙醇,混合15秒后过结合柱,8，OOOxg离心Imin,倒掉废液；⑦加入500 μ L的HB Buffer, 8, OOOxg离心Imin,倒掉废液；⑧加入650 μ L的DNA WashBuffer, 8, OOOxg离心lmin,倒掉废液,重复两次；⑨空柱36，OOOxg离心2min,空气中室温干燥3min ;⑩无菌蒸馏水25~50 μ L，洗脱液DNA，可重复洗脱2次。
[0034](3) DNA质量检测
[0035]提取的样本DNA使用0.7%琼脂糖凝胶电泳(样本DNA5 μ L，marker5 μ L)以及微型分光光度计(样本DNA1.6 μ L)检测样本DNA质量、纯度和浓度。
[0036]把样本DNA分别稀释20、50、100、150、200倍后，取IyL用一对转铁蛋白基因(Transferrin，TF)保守序列区的引物 TFF(5' -GTAACCTGTGGACTTCC ATTCC-3')和 TFR(5' -CAAATTTCATGACCACCTGCC-3')做PCR检测，检测趾甲提取的DNA可稀释倍数，PCR反应结果使用1%琼脂糖凝胶电泳检测(样本DNA3uL, marker5uL)。
[0037](4)线粒体DNA全序列扩增
[0038]根据已知的闭壳龟属其他物种(潘氏闭壳龟、金头闭壳龟、黄额闭壳龟、黄缘闭壳龟以及锯缘箱龟等)的线粒体全序列，用DNASTAR和ClustalXl.8进行对比，并用primer5.0设计连续的、有重叠区的、可覆盖三线闭壳龟线粒体全基因组的引物16对(见表1)考虑到当前的测序能力，PCR产物长度均不超过1600，PCR反应体系为40μL:dNTP (2.5mM) 2.4 μ L,模板 DNAl μ L,弓 I 物(IOymol)各 0.5 μ L，Taq 聚合酶 0.5 μ L，10父81^€64 4 1^，加水至4(^1^ PCR反应条件为:95°C变性2min后，进行30个循环，程序为:95°C变性30s，52°C _60°C退火30s，72°C延伸30s，最后72°C继续延伸IOmin0 PCR反应产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测(样本DNA3uL，marker5uL)，并经纯化试剂盒Gel ExtractPurification Kit (Omega, USA)纯化后，委托上海生工公司进行测序。
[0039]表1用premier5.0设计的可覆盖三线闭壳龟线粒体全基因组的引物
【权利要求】
1.一种利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，其特征是含以下步骤: (1)选取三线闭壳龟的趾甲，预处理后，用MicroEluteGenomic DNA Kit试剂盒提取三线闭壳龟DNA ； (2)设计能覆盖三线闭壳龟线粒体全基因组的16对引物，以步骤(1)中提取获得的三线闭壳龟DNA为模板，利用16对引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序和拼接后，首次扩增获得三线闭壳龟线粒体全长。
2.根据权利要求1所述的利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，其特征是:步骤(1)中所述的预处理包括采用无水乙醇浸泡三线闭壳龟的趾甲以及用IXPBS缓冲液浸泡步骤。
3.根据权利要求1所述的利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，其特征是:步骤(1)中用MicroElute Genomic DNA Kit试剂盒提取三线闭壳龟DNA时，MicroElute Genomic DNA Kit试剂盒中TL Buffer初始加入量为210~220 μ L ;消化时采用摇床气浴，温度为56~60°C,转速为60~70rpm/min,时间为3~5小时；洗脱液为无菌蒸馏水25~50 μ L，重复洗脱2次。
4.根据权利要求1所述的利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，其特征是:步骤(2)中所述的16对引物由以下序列所示的引物组成:SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7 和 SEQ IDN0.8,SEQ ID N0.9和 SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.11和 SEQ ID N0.12,SEQ ID N0.13和 SEQID N0.14、SEQ ID N0.15 和 SEQ ID N0.16、SEQ ID N0.17 和 SEQ ID N0.18、SEQ ID N0.19和 SEQ ID N0.20,SEQ ID N0.21 和 SEQ ID N0.22,SEQ ID N0.23 和 SEQ ID N0.24,SEQ IDN0.25 和 SEQ ID N0.26、SEQ ID N0.27 和 SEQ ID N0.28、SEQ ID N0.29 和 SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.31和 SEQ ID N0.32。
5.根据权利要求1所述的利 用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，其特征是:步骤(2)中PCR扩增时PCR反应体系包括浓度为2.5mM的dNTP2.4 μ L，三线闭壳龟模板DNAl μ L，浓度为10 μ mo I的引物各0.5 μ L, Taq聚合酶0.5 μ L，10 X Buffer4 μ L，加水至40 μ L0
6.根据权利要求1所述的利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，其特征是:步骤(2)中PCR扩增时PCR反应条件为:95°C变性2min后，进行30个循环，每个循环的程序为:95°C变性30s，52°C~60°C退火30s，72°C延伸30s，最后72°C继续延伸lOmin。
7.根据权利要求1所述的利用趾甲提取DNA扩增三线闭壳龟线粒体全长的方法，其特征是:步骤(2)中获得的三线闭壳龟线粒体全长为16675bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.33所示。
【文档编号】C12N15/10GK103865921SQ201410068690
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】朱新平, 李伟, 赵建, 洪孝友 申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所