专利名称：一种柱式高纯度动物mtDNA的提取及纯化方法
技术领域：
本发明属于分子生物学核酸提取纯化技术领域，具体是涉及一种高纯度动物线粒 体DNA的提取及纯化技术。
背景技术：
现有的动物线粒体DNA提取技术主要是碱变性法。该技术采用差速离心法提取线 粒体；SDS碱变性法裂解线粒体；酚抽提法纯化mtDNA。该技术的突出特点是简便快速，因此 该技术在生物学、医学及法医鉴定等领域得到广泛应用。 由于应用该技术提取的线粒体DNA常有残留核DNA、 RNA及苯酚等问题，不能满足 要求高的分子生物学研究，如PGR扩增、酶切及测序等。另外，苯酚等是腐蚀性药品，长期使 用对环境、对操作人有害。因此，只有在此技术的基础上加以改进，提高产品的纯度、消除苯 酚残留，才能满足高水平分子生物学研究的需要，为我国生物学领域的研究与国际接轨提 供保障。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高纯度的动物线粒体DNA提取及 纯化方法。 本发明的技术方案如下一种高纯度的动物线粒体DNA提取及纯化方法，在碱变 性法的基础上加以改进，增加了 DNaseI消化步骤，以消除核DNA的残留；增加了 RNase消化 步骤，以去除RNA的残留；由柱层析法代替酚抽提法纯化mtDNA，解决了苯酚的毒害及其残 留问题。具体步骤如下 (1)匀浆取动物组织于SE液中漂洗、剪碎，加2-50mlSE液，用电动匀浆器1500r/ min慢档上下匀浆20-30s，(或加液氮研磨)； (2)分离线粒体将匀浆物以1000-1500r/min离心10-15min，取上清液；在(TC条 件下，12000r/min离心15min，沉淀即为线粒体。加10mlSE液悬浮沉淀，重复离心一次(即 为较纯的线粒体)。加入10mlSTM液悬浮线粒体，加溶液IV使终浓度为100 y g/ml (以去除 核DNA) ， 37。C温浴，30min， 12000r/min离心10min，弃上清液；加4mlSE液悬浮线粒体，再转 入4个1. 5ml Eppendorf管中，每管lml ; (3)裂解线粒体12000r/min离心8-10min，弃上清液，每管加入150iU溶液I，将 沉淀悬浮后，各加入300 iU新配制的溶液II，混匀，冰浴10min后，再各加225iU4t:的溶 液III，混匀，冰浴25-40min， 12000r/min离心6min ; (4)纯化线粒体DNA :吸取300iil上清液至UNIQ-10Column中，上下颠倒混匀3次， 室温静置3min，使DNA与UNIQ-10柱膜结合，3000r/min离心3min，取下UNIQ-10Column，倒 掉管中废液，将UNIQ-10Column放回收集管中，加入500ii 1 Wash Solution, 8000r/min离 心30s，重复洗涤一次，取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的废液，将柱放回收集管中，lOOOOr/ min离心30s，以除去残留洗液，将柱放入另一洁净的1.5ml离心管中，在柱中央加入50Elution Buffer,室温放置2min， 10000r/min离心lmin，离心管中的液体即为mtDNA ;
(5)加入溶液V，使终浓度为20 ii g/ml，(或37。C温浴60min，重复步骤 )，可立 即使用或保存于-2(TC备用。所述SE液(匀浆缓冲液)0. 25mol/L蔗糖，30mmol/LTris-HCl， 10mmo1/ L Na2EDTA，2. 5mmol/L CaCl2， pH :7. 3-8. 1 ;STM液0. 25mol/L蔗糖，10mmol/LTris-HCl， 0. 5mmol/LMgCl2， pH :8. 0 ;溶液I (TEN) :10mmol/LTris-HCl， 10mmol/LNa2EDTA， 0. 15mol/L NaCl， pH :8. 0 ;溶液II :1% SDS含0. 2N NaOH(用时用10% SDS禾P INNaOH新配制)；溶液 III :KAc溶液，294gKAc，50mL 90%甲酸，加水至1000mL， pH :5. 5 ;溶液IV :DNaseI溶液，用 TE缓冲液配制，浓度5mg/mL ;溶液V :RNaseA溶液，用TE缓冲液溶解RNaseA，以lmg/mL的 浓度配制100mL，煮沸10-15min，分成500ii 1/管，存于-20°C。 Wash Solution :80%的异 丙醇；Elution Buffer :预热(60 70°C )的超纯水或1XTE缓冲液。
前述的提取方法，优选的方案在于，步骤(5)加入溶液V(终浓度20ii g/mL)，加溶 液E，37t:，温浴60min，重复步骤(4)，以更加有效地去除RNA。
与现有技术相比，本发明的优异效果在于
1、提取得到的线粒体DNA纯度高。 2、电泳检测显示电泳条带为清晰、整齐、均匀的一条带；背景清晰，未见点样孔 附近有大分子DNA及前端RNA拖尾等情况。 3、0D值分析显示0D260/0D280值为1. 78-1. 82，能满足线粒体DNA的酶切及测序 分析等研究的要求。 4、提取得到的线粒体DNA溶液内没有苯酚残留。
图1.实施例1所得线粒体DNA的电泳图。 图2.动物线粒体DNA提取及纯化方法的简易流程示意图。
具体实施例方式
以下结合实施例、附图对本发明的技术方案作进一步的详细说明。但本发明不受 这些具体实施例的限制。若大规模实施，可等比例放大。 实施例中所用原料(或设备)均为本领域常规用品，其均可从市场购买。具体 说明如下SE液(匀桨缓冲液)0. 25mol/L蔗糖，30mmol/LTris-HCl， 10mmol/L Na2EDTA， 2. 5,l/LCaCl2， pH :7. 3-8. 1 ;STM液:0. 25mol/L 蔗糖，10,l/LTris-HCl， 0. 5,1/L MgCl2， pH :8. 0 ;溶液I (TEN) :10mmol/LTris-HCl， 10mmol/LNa2EDTA，0. 15mol/L NaCl， pH : 8. 0 ;溶液II :1% SDS含0. 2N NaOH(用时用10% SDS禾P INNaOH新配制)；溶液III :KAc 溶液，294gKAc，50mL 90%甲酸，加水至lOOOmL， pH :5. 5 ;溶液IV :DNaseI溶液，用TE缓冲 液配制，浓度5mg/mL ;溶液V :RNaseA溶液，用TE缓冲液溶解RNaseA，以lmg/mL的浓度配 制100mL，煮沸10-15min，分成500ii 1/管，存于-20。C。 Wash Solution :80%的异丙醇; Elution Buffer :预热(60 70°C )的超纯水或1XTE缓冲液。 其中TE缓冲液:即Tris-EDTA buffer (10mM Tris， ImM EDTA， pH8. 0)，购自上海生 工生物工程技术服务有限公司，配制KAc溶液所用KAc购自上海生工生物工程技术服务有限公司。 实施例1 :蛙线粒体DNA的提取 (1)取2 15g黑斑蛙的肝脏、性腺或肌肉于少量SE匀浆缓冲液中剪碎，加约20 30mLSE液，以电动匀浆器1500r/min上下匀浆30秒，过滤后，将匀浆吸入离心管中。
(2) 1500r/min离心15min吸取上清液。12000r/min离心20min取沉淀，加10mlSE 液悬浮沉淀，重复离心一次，加入10mlSTM液悬浮线粒体，加溶液IV使终浓度为100 y g/ml， 37t:温浴，30min， 12000r/min离心10min，弃上清液，加4mlSE液悬浮线粒体，然后转至4个 1. 5ml Eppendorf管，每管lml 。 (3) 12000r/min离心8min弃上清液，每管加150 yl溶液I将沉淀吹打均匀后 加300 iil新制的溶液II，混匀，冰浴10min，各加225 yl冷溶液III，混匀，冰浴60min， 12000r/min离心6min ; (4)吸取300 ii 1上清至UNIQ-10Col咖n中，上下颠倒混匀3次，室温静置3min， 使DNA与UNIQ-10柱膜结合。3000r/min离心3min，取下UNIQ-10Column，倒掉管中废 液。将UNIQ-10Column放回收集管中，加入500ii 1 Wash Solution, 8000r/min离心30s， 重复洗涤一次。取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中，10000r/min 离心30s，以除去残留洗液。将柱放入另一洁净的1. 5ml离心管中，在柱中央加入50 y 1 ElutionBuffer，室温放置2min， 10000r/min离心lmin，离心管中的液体即为mtDNA。
(5)加溶液V(终浓度为20ii g/ml)，37t:，温浴60min，重复步骤④，可立即使用或 保存于-2(TC备用。 本实施例所得粒体DNA的0D260/0D280值为1. 79，能满足线粒体DNA的PCR扩增、 酶切及测序分析等研究的要求。 图1为本实施例所提取和纯化的mtDNA的电泳图，由图1可以看出电泳条带为清 晰、整齐、均匀的一条带；背景清晰，未见点样孔附近有大分子DNA及前端RNA拖尾等情况。 说明提取的线粒体DNA中未见核DNA和RNA残留。
实施例2 :鱼线粒体DNA的提取。 (1)取5 6g鱼的肝脏或性腺组织，于少量SE溶液中漂洗、剪碎，加约50mlSE，以 电动匀浆器1500r/min上下匀浆30s。 (2)将匀桨物以1000r/min离心15min吸取上清液，12000r/min离心20min，沉 淀即为线粒体。加入4mlSTM液悬浮线粒体，加溶液IV使终浓度为100iig/ml，37t:温 浴，30min， 12000r/min离心10min，弃上清液；加4mlSE液悬浮线粒体，转入4个1. 5ml Eppendorf管中。 (3) 12000r/min离心10min，弃上清液，每管加入150 yl溶液I，将沉淀悬浮后，各 加入300 ii 1新配制的溶液II混匀，冰浴10min后，再各加225 y 1冷溶液III (4°C )，混匀， 冰浴30min， 12000r/min离心6min ; (4)吸取300 ii 1上清至UNIQ-10Col咖n中，上下颠倒混匀3次，室温静置3min， 使DNA与UNIQ-10柱膜结合。3000r/min离心3min，取下UNIQ-10Column，倒掉管中废液。 将UNIQ-10Column放回收集管中，加入500ii 1 Wash Solution, 8000r/min离心30s，重复 洗涤一次。取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中，10000r/min离心 30s，以除去残留洗液。将柱放入另一洁净的1. 5ml离心管中，在柱中央加入50ii1 ElutionBuffer,室温放置2min， 10000r/min离心lmin，离心管中的液体即为mtDNA。 (5)加入溶液V(终浓度20 g/mL)，可立即使用或保存于-2(TC备用。本实施例所得粒体DNA的0D260/0D280值为1.81，能满足线粒体DNA的PCR扩增、
酶切及测序分析等研究的要求。 实施例3 :蜜蜂线粒体DNA提取纯化 (1)取新鲜蜜蜂或酒精浸泡标本，加液氮研磨，加约5 10mLSE液，混匀，过滤后， 将匀浆吸入离心管中。 (2) 1500r/min离心15min吸取上清液。12000r/min离心20min取沉淀，加 入2mlSTM液悬浮，加溶液IV使终浓度为lOOii g/ml，37。C温浴，30min， 12000r/min离心 10min，弃上清液，加2mLSE液悬浮，然后转至2个1. 5ml Eppendorf管，每管1ml 。
(3) 12000r/min离心8min弃上清液，每管加150 y L溶液I将沉淀吹打均匀后 加300iiL新制的溶液II，混匀，冰浴10min，各加225yL冷溶液III，混匀，冰浴60min， 12000r/min离心6min ; (4)吸取300 ii 1上清至UNIQ-10Col咖n中，上下颠倒混匀3次，室温静置3min， 使DNA与UNIQ-10柱膜结合。3000r/min离心3min，取下UNIQ-10Column，倒掉管中废 液。将UNIQ-10Column放回收集管中，加入500ii 1 Wash Solution, 8000r/min离心30s， 重复洗涤一次。取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中，10000r/min 离心30s，以除去残留洗液。将柱放入另一洁净的1. 5ml离心管中，在柱中央加入50 y 1 ElutionBuffer，室温放置2min， lOOOOr/min离心lmin，离心管中的液体即为mtDNA。
(5)加入溶液V(终浓度20 g/mL)，可立即使用或保存于-2(TC备用。
实施例4 :跳虫线粒体DNA提取纯化 (1)取新鲜跳虫或酒精浸泡标本于少量SE匀浆缓冲液中剪碎，加约2 5mlSE液，
以电动匀浆器1500r/min上下匀浆20s，过滤后，将匀浆吸入离心管中。 (2) 1500r/min离心15min吸取上清液，再12000r/min离心20min取沉淀，加入
2mlSTM液悬浮线粒体，加溶液IV使终浓度为100ii g/ml，37。C温浴，30min， 12000r/min离心
10min，弃上清液，加lmLSE液悬浮线粒体，然后转至1个1. 5ml E卯endorf管中。 (3) 12000r/min离心8min弃上清液，每管加150 y L溶液I将沉淀吹打均匀后
加300iiL新制的溶液II，混匀，冰浴10min，各加225yL冷溶液III，混匀，冰浴60min，
12000r/min离心6min ; (4)吸取300 ii 1上清至UNIQ-10Col咖n中，上下颠倒混匀3次，室温静置3min， 使DNA与UNIQ-10柱膜结合。3000r/min离心3min，取下UNIQ-10Column，倒掉管中废 液。将UNIQ-10Column放回收集管中，加入500ii 1 Wash Solution, 8000r/min离心30s， 重复洗涤一次。取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中，10000r/min 离心30s，以除去残留洗液。将柱放入另一洁净的1. 5ml离心管中，在柱中央加入50 y 1 ElutionBuffer，室温放置2min， 10000r/min离心lmin，离心管中的液体即为mtDNA。加入 溶液V(终浓度20 ii g/ml)，可立即使用或保存于-2(TC备用。 本实施例所得粒体DNA的0D260/0D280值为1. 82，能满足线粒体DNA的酶切及测 序分析等研究的要求。
权利要求
一种柱式高纯度动物mtDNA的提取及纯化方法，其特征在于，在碱变性法的基础上增加DNaseI消化步骤，以消除核DNA的残留；增加RNase消化步骤，以去除RNA的残留；由柱层析法代替酚抽提法纯化mtDNA，解决苯酚的毒害及残留问题。
2. 权利要求1所述的提取及纯化方法，其特征在于，具体步骤如下(1) 匀浆取动物组织于SE液中漂洗、剪碎，加2-50mlSE液，用电动匀浆器1500r/min慢档上下匀浆20-30s ;(2) 分离线粒体将匀桨物以1000-1500r/min离心10-15min，取上清液；在0°C条件下，12000r/min离心15min，沉淀即为线粒体。加10mlSE液悬浮沉淀，重复离心一次即得较纯的线粒体，加入10mlSTM液悬浮线粒体，加溶液IV使终浓度为lOOii g/ml，37t:温浴，30min， 12000r/min离心10min，弃上清液；加4mlSE液悬浮线粒体，再转入4个1. 5mlEppendorf管中，每管lml ;(3) 裂解线粒体:12000r/min离心8-10min，弃上清液，每管加入150 yl溶液I，将沉淀悬浮后，各加入300 iU新配制的溶液II，混匀，冰浴10min后，再各加225iU4t:的溶液III，混匀，冰浴25-40min， 12000r/min离心6min ;(4) 纯化线粒体DNA :吸取300 ii 1上清液至UNIQ-10Column中，上下颠倒混匀3次，室温静置3min，使DNA与UNIQ-10柱膜结合，3000r/min离心3min，取下UNIQ-10Column，倒掉管中废液，将UNIQ-10Column放回收集管中，加入500ii 1 Wash Solution, 8000r/min离心30s，重复洗涤一次，取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的废液，将柱放回收集管中，lOOOOr/min离心30s，以除去残留洗液，将柱放入另一洁净的1.5ml离心管中，在柱中央加入50Elution Buffer,室温放置2min， 10000r/min离心lmin，离心管中的液体即为mtDNA ;(5) 加入溶液V，使终浓度为20ii g/ml，可立即使用或保存于-2(TC备用；所述SE液0.25mol/L蔗糖，30mmol/LTris-HCl，10mmol/L Na2EDTA， 2. 5mmol/L CaCl2， pH :7. 3-8. 1 ;STM液:0. 25mol/L蔗糖，10,1/LTris-HCl， 0. 5mmol/L MgCl2， pH :8. 0 ;溶液I :10mmol/LTris-HCl， 10mmol/LNa2EDTA， 0. 15mol/L NaCl， pH :8. 0 ;溶液II : 1 % SDS含0. 2N Na0H ;溶液III :KAc溶液，294gKAc，50mL 90%甲酸，加水至1000mL， pH :5. 5 ;溶液IV :DNaseI溶液，用TE缓冲液配制，浓度5mg/mL ;溶液V :RNaseA溶液，用TE缓冲液溶解RNaseA，以lmg/mL的浓度配制lOOmL，煮沸10-15min，分成500 ii 1/管，存于_20°CWash Solution :80%的异丙醇;Elution Buffer :预热(60 70°C )的超纯水或1XTE缓冲液。
3. 权利要求2所述的提取及纯化方法，其特征在于，步骤(1)匀浆也可以取动物组织加液氮研磨。
4. 权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(5)加溶液E使终浓度20ug/mL，在37t:温浴60min，再重复操作步骤(4)，产品-2(TC冻存备用。
5. 权利要求2所述的提取及纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中动物组织为黑斑蛙的肝脏、性腺或肌肉。
6.权利要求5所述的提取及纯化方法，其特征在于，所述动物组织为鱼的肝脏或性腺组织。
全文摘要
本发明公开了一种柱式高纯度的动物线粒体DNA提取及纯化方法，在碱变性法的基础上加以改进，增加了DNaseI消化步骤，以消除核DNA的残留；增加了RNase消化步骤，以去除RNA的残留；由柱层析法代替酚抽提法纯化mtDNA，解决了苯酚的毒害及其残留问题。本方法提取得到的线粒体DNA纯度高。电泳检测显示电泳条带为清晰、整齐、均匀的一条带；背景清晰，未见点样孔附近有大分子DNA及前端RNA拖尾等情况。
文档编号C12N15/10GK101717773SQ20091023127
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月18日 优先权日2009年12月18日
发明者杜廷广, 闫华超 申请人:聊城大学