专利名称：一种制备宝霍苷i纯品的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备宝霍苷I纯品的方法。主要包括淫羊藿苷的葡聚糖酶水解，及宝霍苷I的反相高效液相制备纯化。
背景技术：
淫羊藿(Herba Epimedii)隶属小檗科(Berberridaceae)淫羊藿属，为常用中药，具有强筋骨，祛风湿，抗病毒等功效。现代药理研究发现，淫羊藿中宝霍苷I等去糖后的低分子量化合物具有比含量较高的淫羊藿苷具有更高的活性。目前市场上，宝霍苷I非常稀缺，而且价格昂贵，而对宝霍苷I的需求越来越大，因此开发宝霍苷I的制备方法是非常有意义的。根据现有的专利及文献，宝霍苷的主要制备方法有酸水解法，碱水解法以及酶水解法。酸碱水解法，方法简单，然而由于其水解环境剧烈，制备出的宝霍苷I往往活性损失较大。酶水解法主要采用β-葡萄糖苷酶，然而其活性较低，水解效率低，原材料浪费严重。葡聚糖酶也叫β-1，3_1，4葡聚糖酶，是一种专一作用于β-葡聚糖的1，3及1，4糖苷键的内切酶。该酶可以通过Bacillus Lichenifomis菌株经过液态深层发酵制得,制备工艺路线成熟，是一种廉价高活性的葡萄糖苷键水解酶。其活性非常高，水解淫羊藿苷为宝霍苷I的转化率最高大于98%，且通过合适的回收，酶可二次利用，第二次的转化率大于50%，充分利用了原材料，节省了成本。本文首次尝试采用葡聚糖酶作为淫羊藿苷的水解酶，将相对价廉易得的淫羊藿苷纯品，转化为学术及经济价值均较高的宝霍苷I纯品，并对其生产条件进行了优化研究。结果发现，葡聚糖酶具有很高的内切酶活性，可以高产量的转化淫羊藿苷为宝霍苷I，同时结合反相高效制备色谱技术，可以制备高纯宝霍苷I纯品。
发明内容
本发明主要目的在于通过葡聚糖酶水解淫羊藿苷制备宝霍苷I粗品，并进一步通过反相高效制备液相纯化，制备的宝霍苷I纯品纯度大于98%。主要技术流程如下所示:1.一种宝霍苷I纯品的制备方法，其特征在于:以淫羊藿苷为原料，葡聚糖酶水解及反相高效制备色谱纯化，即可获得纯度大于98%的宝霍苷I纯品；具体步骤如下:I)淫羊藿苷葡聚糖酶水解获得宝霍苷I粗品:将l-25mg淫羊藿苷用IO-1OOml PH为4_7的柠檬酸缓冲溶液溶解，加入40-150ul、4-10ug/ul的葡聚糖酶水溶液，保持19-80摄氏度并搅拌3-6小时，即可将绝大部
分淫羊藿苷转化为宝霍苷I ;得宝霍苷I沉淀；宝霍苷I沉淀经水洗除去部分酶和大部分葡萄糖，进一步用-4到4摄氏度冷甲醇溶解除去残余酶和不溶沉淀，上清液浓缩干燥即可得到宝霍苷I粗品；经过处理后的宝霍苷I含量大于90%。2)反相高效制备液相获得宝霍苷I纯品宝霍苷I粗品用甲醇溶解，经0.45u m微膜过滤；采用Waters DP4000高效制备系统，采用C18反相填料制备色谱柱分离纯化，优选10-20um粒径的C18硅胶键合填料，以100% -70%甲醇为洗脱剂等度洗脱，0.45um滤膜处理样品，通过微膜滤出的样品上样分析。采用紫外检测器检测，检测波长270nm，宝霍苷I在10分钟内流出，收集相应保留时间处馏分(通常为3-9分钟的馏分)，浓缩干燥后既得宝霍苷I纯品，得到的宝霍苷I含量大于 98%。水解步骤中柠檬酸缓冲体系的PH值控制在4-7。宝霍苷I纯品获得采用反相高效制备色谱柱，填料优选10_20um C18键合硅胶，柱效大于等于2500。本发明以淫羊藿苷为原料，通过葡聚糖酶水解和高效制备系统获得目标产物宝霍苷I纯品，与传统方法相比具有以下优点:1)葡聚糖酶水解能力强，淫羊藿苷转化为宝霍苷I的转化率最高可达98%，且酶可二次利用，充分利用了原材料。2)以反相高效制备液相为手段，可以制备高纯度宝霍苷I，纯度大于98%。通过不同填料选择进行制备柱自装填，有效提高宝霍苷I的选择性。3)采用等度条件，分离快速，高效，而且宝霍苷出峰时间短，出峰时间在3-9分钟内。4)操作过程简单，无需复杂样品处理手段，适合大规模生产制备
图1为淫羊藿苷原料的HPLC分析图(270nm)，其积分报告如下:
权利要求
1.一种宝霍苷I纯品的制备方法，其特征在于:以淫羊藿苷为原料，葡聚糖酶水解及反相高效制备色谱纯化，即可获得纯度大于98%的宝霍苷I纯品；具体步骤如下: 1)葡聚糖酶水解: 将l_25mg淫羊藿苷用IO-1OOml柠檬酸缓冲溶液溶解，加入40-150ul、4_10ug/ul的葡聚糖酶水溶液，保持19-80摄氏度并搅拌3-6小时，获得宝霍苷I沉淀； 宝霍苷I沉淀经水洗除去部分酶和大部分葡萄糖，进一步用-4到4摄氏度冷甲醇溶解除去残余酶和不溶沉淀，上清液浓缩干燥即可得到宝霍苷I粗品； 2)反相高效制备液相纯化: 宝霍苷I粗品用甲醇溶解，经0.45um微膜过滤；通过微膜滤出的样品上样分析，采用C18反相填料制备色谱柱分离纯化，采用C18键合硅胶填料，采用体积浓度70-100%甲醇水溶液等度洗脱，采用紫外检测器检测，检测波长270nm，收集相应保留时间处馏分，浓缩干燥即得纯度大于98%的宝霍苷I纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:水解步骤中柠檬酸缓冲体系的PH值控制在4-7，水解时间控制在3-6小时，水解温度控制在19-80摄氏度。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:宝霍苷I纯品获得采用反相高效制备色谱柱，填料优选10-20um C1 8键合硅胶，柱效大于等于2500。
全文摘要
本发明涉及一种制备宝霍苷I纯品的方法。以实验室自制的淫羊藿苷(纯度大于98％)为原料，经过葡聚糖酶水解，得到含量大于90％的宝霍苷I粗品，用反相高效制备色谱作为纯化手段，得到纯度大于98％的宝霍苷I纯品。本发明工艺步骤简单、纯度高、成本低，并且可大规模生产。
文档编号C07H1/06GK103160553SQ20111042819
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者肖红斌, 杨乾栩, 王莉 申请人:中国科学院大连化学物理研究所