专利名称：利用鳆发光杆菌检测环境污染物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物，特别是涉及一株可用于环境污染物检测的海洋发光细菌 Photobacteriumleiognathi YL 菌株。
背景技术：
据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，目前已知的海洋发光细菌只有三属， 分别是弧菌属(Vibrio)，明亮发光菌属(PhotcAacterium)，及希瓦氏菌属(Shewanella)， 陆地上则有异短杆菌属(Xenorhabdus)。在有氧的自然环境下，发光细菌可产生荧光素酶 (LE)，催化黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛类发生氧化反应，而发出蓝绿色的荧光。目前在我国应用较广的是明亮发光杆菌(PhotcAacterium phosphoreum)，利用 明亮发光杆菌进行环境污染物检测的研究有所报道。而除了明亮发光杆菌以外，均没有 利用其他种属的发光细菌进行环境污染物检测的报道。本发明中涉及的菌种鳆发光杆菌 (Photobacterium leiognathi)与明亮发光杆菌(Photobacteriumphosphoreum)为同属 异种，在菌体形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列上二者均有很大差异。但该菌株 Photobacterium leiognathi YL表现出稳定的发光性能，对环境污染物敏感，作为环境污 染物的指示菌，可以用于环境污染物的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一株来源于海洋环境的发光细菌菌株Wiotobacterium leiognathi YL(鳆发光杆菌以及利用该菌株进行环境污染物的定量检测。本发明分离纯化出一株来源于海洋环境的发光细菌1，该菌种为革兰氏阴性菌， 杆状(附图1)。结合16S rDNA测序结果构建的系统发育树(附图2)和生理生化结果(表 1)，发光细菌1被鉴定为鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)。该菌株于2006年12 月27日委托中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏号为M 206139。该菌株的 16S rDNA基因序列已经提交GenBank核酸序列数据库，存取号为EF017227。该菌株具有发 光特性，能够用来检测环境污染物。该菌株具有生长快、发光性能稳定、对营养要求低、对环境污染物敏感等特点，荧 光扫描确定该发光细菌的发光强度在474nm形成最大峰。多种受试环境污染物的浓度与污 染物对该菌株Wiotobacteriumleiognathi YL发光强度抑制率呈正比，能够实现对受试环 境污染物的定量检测。利用本菌株检测环境污染物具有成本低、操作简便、灵敏度高等特 点，能够满足多种污染物的快速检测的需要。
附图1发光细菌孔扫描电镜照片。附图2根据细菌16S rDNA序列分析结果构建的系统发育树，括号内为该菌株在 GenBank中的收录号，分支上的数字代表置信度。
附图3发光细菌1的发光光谱图。附图4 2+浓度与发光细菌YL发光抑制率的线性关系图。附图5Cu2+浓度与发光细菌YL发光抑制率的线性关系图。附图6pb2+浓度与发光细菌YL发光抑制率的线性关系图。附图7氯霉素浓度与发光细菌YL发光抑制率的线性关系图。
具体实施例方式实施例1从青岛近海捕得常见海产品，包括鱿鱼、对虾、黄鱼、黑头鱼、安康鱼等。将各种水 产品分割成小块置于固体培养基平板内，在隔水式恒温培养箱25°C恒温培养10h，暗室观 察发光情况。标记发光的菌落，进行平板划线培养。经过多次分离纯化，得到发光细菌YL。实施例2取发光细菌YL单菌落接种于IOOml液体培养基中(培养基组成蛋白胨5g、酵母 膏lg、FePO4 0. lg、NaCl 20g、甘油3ml、蒸馏水1000ml)，27°C摇床培养8hr使菌体达到对 数生长末期。取5ml不同浓度的重金属锌溶液加入到5ml菌液中，27°C摇床培养反应20min。反 应完毕后，于微弱发光测量仪中测量发光值，测量时间为50s，结果取平均值。从测定结果可 知抑制率和Si2+浓度成正比(图4)，因而在进行食品或环境中该种污染物的测定时，可根 据抑制率推测出污染物的含量。实施例3取发光细菌YL单菌落接种于IOOml液体培养基中(培养基组成蛋白胨5g、酵母 膏lg、FePO4 0. lg、NaCl 20g、甘油3ml、蒸馏水1000ml)，27°C摇床培养8hr使菌体达到对 数生长末期。取5ml不同浓度的重金属铜溶液加入到5ml菌液中，27°C摇床培养反应20min。反 应完毕后，于微弱发光测量仪中测量发光值，测量时间为50s，结果取平均值。从测定结果可 知抑制率和Cu2+的浓度成正比(图幻，因而在进行食品或环境中该种污染物的测定时，可 根据抑制率推测出污染物的含量。实施例4取发光细菌YL单菌落接种于IOOml液体培养基中(培养基组成蛋白胨5g、酵母 膏lg、FePO4 0. lg、NaCl 20g、甘油3ml、蒸馏水1000ml)，27°C摇床培养8hr使菌体达到对 数生长末期。取5ml不同浓度的重金属铅溶液加入到5ml菌液中，27°C摇床培养反应20min。反 应完毕后，于微弱发光测量仪中测量发光值，测量时间为50s，结果取平均值。从测定结果可 知抑制率和Pb2+的浓度成正比(图6)，因而在进行食品或环境中该种污染物的测定时，可 根据抑制率推测出污染物的含量。实施例5取发光细菌YL单菌落接种于IOOml液体培养基中(培养基组成蛋白胨5g、酵母 膏lg、FePO4 0. lg、NaCl 20g、甘油3ml、蒸馏水1000ml)，27°C摇床培养6hr使菌体达到对 数生长初期。
取5ml不同浓度的氯霉素溶液加入到5ml菌液中，27°C摇床培养反应20min。反应 完毕后，于微弱发光测量仪中测量发光值，测量时间为50s，结果取平均值。从测定结果可知 抑制率和氯霉素的浓度成正比(图6)，因而在进行食品或环境中该种污染物的测定时，可 根据抑制率推测出污染物的含量。表1 1与其他相近菌种的生理生化特征比较
Photobacterium 明亮发光杆菌 哈维氏弧菌 美丽发光弧菌 费氏弧菌 leiognathi YL P. phosphoreum V. harveyi V. splendidus V. fischeri
固体培养基上 的侧生鞭毛 直的杆菌 PHB积累 精氨酸双水解 酶 氧化酶 发光 接触酶反应
V. P实验 精氨酸双水解 酶
0/129敏感 N03—还原为N02_ 利用葡萄糖 产气 生长时需要Na+ 形成3—羟基丁 酮和/或二乙酰
权利要求
1.一种能定量检测环境污染物的鳆发光细菌Wiotobacterium Ieiognathi 1菌株，其 保藏号为CCTCC M206139
2.权利要求1所述的菌株在环境污染物检测中的应用。
全文摘要
本发明的目的是提供一株来源于海洋环境的鳆发光细菌Photobacterium leiognathi YL以及利用该菌株进行环境污染物的定量检测。本发明分离纯化出一株来源于海洋环境的发光细菌YL，该菌种为革兰氏阴性菌，杆状。根据16S rDNA测序结果构建的系统发育树和生理生化结果，发光细菌YL被鉴定为鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)。该菌种于2006年12月27日委托中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏号为M 206139。该发光细菌的16S rDNA基因序列已经提交GenBank核酸序列数据库，存取号为EF017227。该菌株具有生长快、发光性能稳定、对营养要求低、对环境污染物敏感等特点，荧光扫描确定该发光细菌的发光强度在474nm形成最大峰。发光强度抑制率与多种受试环境污染物的浓度呈正比，能够实现对受试环境污染物的定量检测。利用本菌株检测环境污染物具有成本低、操作简便、灵敏度高等特点，能够满足污染物的快速检测的需要。
文档编号C12R1/01GK102071159SQ200910230499
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月20日 优先权日2009年11月20日
发明者朱兰兰, 林洪, 王亚群, 王静雪 申请人:中国海洋大学