利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法
【专利说明】利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法
[0001] 本发明涉及蛋白酶重组纯化技术应用领域，特别是一种利用大肠杆菌纯化和提高 切割蛋白酶活性的方法。
【背景技术】
[0002] 目前，在蛋白切割方面普遍采用PPase或者thrombin两种酶，然而这两种酶都是 单重标签，其选择性和实用性比较单一；为了克服上述缺点，技术人员重组了切割蛋白酶， 这种切割蛋白酶具有双重标签，其选择性和实用性较强，但是在重组、表达和纯化方法上还 是不成熟，存在着生产效率低、生产周期长的缺点。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋 白酶活性的方法。
[0004] 实现上述目的本发明的技术方案为，一种利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活 性的方法，该方法包括如下步骤： (1 )、分子克隆，选择pET-28a(+)为目标蛋白的载体，并且在His标签前段加入GST融 合蛋白，以EcoRI和NotI为限制性酶切位点设计引物进行PCR实验扩增目的基因： 上游引物：TTGGATCCCATATGGGCCCGAGCCTTGACTTTG下游引物：AGTGCGGCCGCTTATTGTTCACTAGCAAAGTAAC 取一定量的上述PCR体系将扩增目的基因，利用琼脂糖凝胶电泳取鉴定PCR产物，如果 出现500bp的条带则可以证明PCR得到了目标产物，可以进行下一步的胶回收和双酶切实 验； (2) 、融合蛋白，将胶回收后的PCR扩增产物与已连入GST蛋白序列的pET-28a空载体 分别进行双酶切反应，然后将双酶切得到的具有粘性末端的PCR产物和线性pET-28a载体 利用T4连接酶进行过夜连接，再将得到的的重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行质粒的扩 增，提取DH5α中的重组质粒备用； (3) 、蛋白表达，在重组质粒转化入E.coliROSETTA菌株中后，进行小量蛋白的试表达， 可选取重组蛋白5mLDotblot进行试表达。，试表达成功后对转化入E.coliROSETTA菌株 中的重组质粒进行大量表达得到切割蛋白酶； (4) 、蛋白纯化，将大量表达后的切割蛋白酶进行IMAC和肝素阳离子交换层析实验对 其进行纯化； (5) 、酶活测定，经过步骤（4)的纯化后，得到得到20°C，常压条件下适宜的切割蛋白 酶，切割蛋白酶的酶活缓冲液为10mMMES，PH6. 7,酶活缓冲液的蛋白体系终浓度15μΜ，底 物体系终浓度为〇. 〇4mM。
[0005] 所述步骤（1)中一定量的上述PCR体系将扩增目的基因的具体量为过50μL。
[0006] 所述步骤（2)中在DH5a中提出重组质粒后，还要通过双酶切验证，确定之前的链 接反应是否正确。
[0007] 所述步骤（5)中通过酶活缓冲液最终得到的FRET酶活体系见下表：
[0008] 所述K"为测定初速度与浓度的非线性拟合曲线。
[0009] 利用本发明的技术方案制作的切割蛋白酶，与PPase或者thrombin相比，其优势 在于具有双重标签，这便使其在蛋白切割方面有了更多的选择性和实用性；并且切割蛋白 酶在大肠杆菌中进行纯化表达，1L菌液可拿到20mg左右的蛋白，相较其他蛋白酶，具有效 率高，周期短的优势。
【附图说明】
[0010] 图1是本发明所述证明PCR得到了目标产物的示意图； 图2是本发明所述证明扩增后重组质粒的示意图； 图3是本发明所述重组质粒双酶切鉴定的示意图； 图中，泳道1为37°C，酶切15min的状态；Μ为maker; 图4是本发明所述小量蛋白（5mLDotblot)试表达的示意图； 图中，1，37°C表达30min;2,37°C表达2h;3,菌株用IPTG诱导前；4,阴性对照，菌株转 入空载pET-28a(+)质粒； 图5是本发明所述FPLC以及蛋白纯化结果蛋白胶图； 图6是本发明所述K"曲线示意图； 图7是本发明所述证明切割蛋白酶具有GST和HIS双重标签的曲线图； 图8是本发明所述切割蛋白酶在底物选择上的对比图； 图9是本发明所述切割蛋白酶与同类产品在切割效果上的对比图（圆点代表本产品、 方框代表PPase酶、三角代表TEV酶）； 图10本发明所述的切割蛋白酶在不同酶活体系中的活性对比图。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合附图对本发明进行具体描述，一种利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶 活性的方法，该方法包括如下步骤： (1 )、分子克隆，选择pET-28a(+)为目标蛋白的载体，并且在His标签前段加入GST融 合蛋白，以EcoRI和NotI为限制性酶切位点设计引物进行PCR实验扩增目的基因： 上游引物：TTGGATCCCATATGGGCCCGAGCCTTGACTTTG 下游引物：AGTGCGGCCGCTTATTGTTCACTAGCAAAGTAAC 取一定量的上述PCR体系将扩增目的基因，利用琼脂糖凝胶电泳取鉴定PCR产物，如果 出现500bp的条带则可以证明PCR得到了目标产物，如图1所示，可以进行下一步的胶回收 和双酶切实验； (2) 、融合蛋白，将胶回收后的PCR扩增产物与已连入GST蛋白序列的pET-28a空载体 分别进行双酶切反应，如图3所示，然后将双酶切得到的具有粘性末端的PCR产物和线性 pET_28a载体利用T4连接酶进行过夜连接，再将得到的的重组质粒转入大肠杆菌DH5 α中 进行质粒的扩增，提取DH5 α中的重组质粒备用，如图2所示； (3) 、蛋白表达，在重组质粒转化入E.coliROSETTA菌株中后，进行小量蛋白的试表达， 如图4所示，可选取重组蛋白5mLDotblot进行试表达。，试表达成功后对转化入E.coli ROSETTA菌株中的重组质粒进行大量表达得到切割蛋白酶； (4) 、蛋白纯化，将大量表达后的切割蛋白酶进行IMAC和肝素阳离子交换层析实验对 其进行纯化，如图5所示； (5) 、酶活测定，经过步骤（4)的纯化后，得到得到20°C，常压条件下适宜的切割蛋白 酶，切割蛋白酶的酶活缓冲液为10mMMES，PH6. 7,酶活缓冲液的蛋白体系终浓度15μΜ，底 物体系终浓度为〇. 〇4mM。
[0012] 所述步骤（1)中一定量的上述PCR体系将扩增目的基因的具体量为过50μL。
[0013] 所述步骤（2)中在DH5a中提出重组质粒后，还要通过双酶切验证，确定之前的链 接反应是否正确。
[0014] 所述步骤（5)中通过酶活缓冲液最终得到的FRET酶活体系见下表：
[0015] 所述K"为测定初速度与浓度的非线性拟合曲线，如图6所示。
[0016] 切割蛋白酶是一种由人类肠道病毒的3C蛋白酶、GST和组氨酸便签组成的融合蛋 白，本发明所述的切割蛋白酶是通过大肠杆菌来重组和表达的，其具有效率高、周期短的特 点，且这种蛋白酶可特异识别短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro中的Gin和Gly残 基而进行切割，底物的识别和切割不仅依赖于融合蛋白的一级结构还依赖于融合蛋白的二 级和三级结构。它可以特异性的将带有GST标签和HIS标签等一系列等载体表达出的带有 酶底物识别多肽序列融合蛋白的GST标签和His标签进行分离。
[0017] 其中3C蛋白酶由一条长183个氨基酸的多肽链折叠而成，其折叠后形成了两个对 称的由6个β折叠结构组成的桶装结构域，一个浅而长的底物结合沟位于两个结构域之 间。3C蛋白酶的酶切功能区是由催化三联体Cysl47、His40和Glu71组成的拓扑立体结构 构成，催化三体中Cysl47作为底物羰结合位点，是酶切的执行者。
[0018] 本发明所述的切割蛋白酶带有GST和HIS双重标签，这就为其的纯化方法提供了 多重选择，使用更为灵活多变，如图7所示。本发明所述的切割蛋白酶在底物的选择上有其 针对性，有图8可知，虽然对于不同的底物本发明所述的切割蛋白酶均有活性，但是通过对 t匕，其对于特定底物具有选择性。如图9所示，本发明所述的切割蛋白酶的酶切效果明显比 同类产品好。如图10所示，切割蛋白酶在不同的酶活体系中均具有活性，这为其切割不同 的蛋白，提供了可能、 上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其 中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之 内。
【主权项】
1. 一种利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在于，该方法包括如 下步骤： (1 )、分子克隆，选择pET-28a (+)为目标蛋白的载体，并且在His标签前段加入GST融 合蛋白，以EcoR I和Not I为限制性酶切位点设计引物进行PCR实验扩增目的基因： 上游引物：TTGGATCCCATATGGGCCCGAGCCTTGACTTTG 下游引物：AGTGCGGCCGCTTATTGTTCACTAGCAAAGTAAC 取一定量的上述PCR体系将扩增目的基因，利用琼脂糖凝胶电泳取鉴定PCR产物，如果 出现500bp的条带则可以证明PCR得到了目标产物，可以进行下一步的胶回收和双酶切实 验； (2) 、融合蛋白，将胶回收后的PCR扩增产物与已连入GST蛋白序列的pET-28a空载体 分别进行双酶切反应，然后将双酶切得到的具有粘性末端的PCR产物和线性pET-28a载体 利用T4连接酶进行过夜连接，再将得到的的重组质粒转入大肠杆菌DH5 α中进行质粒的扩 增，提取DH5 α中的重组质粒备用； (3) 、蛋白表达，在重组质粒转化入E.coli ROSETTA菌株中后，进行小量蛋白的试表 达，试表达成功后对转化入E. coli ROSETTA菌株中的重组质粒进行大量表达得到切割蛋白 酶； (4) 、蛋白纯化，将大量表达后的切割蛋白酶进行IMAC和肝素阳离子交换层析实验对 其进行纯化； (5) 、酶活测定，经过步骤（4)的纯化后，得到得到20°C，常压条件下适宜的切割蛋白 酶，切割蛋白酶的酶活缓冲液为10mM MES，PH6. 7,酶活缓冲液的蛋白体系终浓度15μΜ，底 物体系终浓度为〇. 〇4mM。2. 根据权利要求1所述的利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在 于，所述步骤（1)中一定量的上述PCR体系将扩增目的基因的具体量为过50 μ L。3. 根据权利要求1所述的利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在 于，所述步骤（2)中在DH5a中提出重组质粒后，还要通过双酶切验证，确定之前的链接反应 是否正确。4. 根据权利要求1所述的利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在 于，所述步骤（5)中通过酶活缓冲液最终得到的FRET酶活体系见下表：〇5.根据权利要求4所述的利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在 于，所述K"为测定初速度与浓度的非线性拟合曲线。
【专利摘要】本发明公开了一种利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，该方法利用大肠杆菌通过分子克隆、融合蛋白、蛋白表达、蛋白纯化和酶活测定五个步骤重组表达切割蛋白酶。本发明的有益效果是，酶切效率高，重组周期短。
【IPC分类】C12N9/50, C12N15/70
【公开号】CN105463004
【申请号】CN201410442218
【发明人】朱丹, 曹林
【申请人】天津舒伯格文科技有限公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2014年9月2日