一种新脲酶辅基基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种辅基新基因及其应用，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 80年代的研究，证实酒精饮料中含有致癌性化学物质氨基甲酸乙酯(EC)，此物在 酒精饮料中主要来源于酿造、煎酒和储存过程中，酒精饮料内所含尿素和乙醇以非酶催化 的化学反应形成。据报道向发酵酒中添加少量酸性脲酶可以有效去除酒中尿素，进而控制 致癌物质氨基甲酸乙酯含量。
[0003]本实验室所构建的重组酸性脲酶具有与来源于普罗维登斯菌JN-B815产酸性脲酶 相同的双功能酶性质，既能分解尿素，同时也能以EC作为底物最终生成氨气和水。
[0004]目前，日本、美国等国研究者不仅筛选到分解酒精饮料中尿素的微生物菌种，研究 了脲酶的酶学特性和应用的条件，并且已有商品化的脲酶投入应用。而我国出口的黄酒中 所用脲酶均从国外进口，国内尚未形成生产规模，而国际关于氨基甲酸乙酯降解酶的报道 也较少。因此研究酒用酸性脲酶特别是同时具有氨基甲酸乙酯降解酶活性的酸性脲酶对我 国酿酒业品质提升具有深远意义。
【发明内容】
[0005]本发明的第一个目的提供一种新的脲酶辅基基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 不。
[0006]含有所述脲酶基因的基因工程菌、表达载体或克隆载体均属于本发明要求保护的 范围。
[0007]本发明要解决的第二个目的是提供一种提高脲酶活性的方法，主要涉及所述脲酶 辅基基因在提高脲酶活性中的应用，所述辅基基因与脲酶功能基因共表达。
[0008]所述共表达为采用独立启动子分别表达，具体方法为将权利要求1所述脲酶辅基 基因及脲酶结构基因以双启动子表达的方式导入E.coliBL21中得到一种基因工程菌。
[0009]所述普罗维登斯菌JN-B815由本实验室筛选，保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏编号:CGMCCNo. 8326。
[0010]本发明的第三个目的是提供重组E.coliBL21(DE3)诱导表达全亚基酸性脲酶包 涵体的方法。
[0011] 本发明的第四个目的是提供一种高纯度脲酶包涵体的复性方法。
[0012] 所述一种胞内表达来源于普罗维登斯菌JN-B815酸性脲酶的重组E.coliBL21 (DE3)的构建方法，是将来源于普罗维登斯菌JN-B815的酸性脲酶结构基因ureABC及脲酶辅 基基因ureEFGD分步导入E.coliBL21(DE3)中得到基因工程菌。利用构建好的工程菌发酵 制备含有全亚基的重组酸性脲酶包涵体，并对酸性脲酶包涵体进行纯化及复性。
[0013] 克隆方法可以采用化学合成法或PCR方法，本实验以PCR方法为例，但不限于PCR方 法，具体步骤为：
[0014] (1)用酸性脲酶结构基因序列设计一对引物Fs、Rs(序列分别如SEQIDN0.3、SEQ 10从).4所示），以普罗维登斯菌见-8815基因组为模板扩增出目的基因1^48(：:
[0017]下划线表示酶切位点碱基序列。
[0018] (2)将目的基因ureABC连接至pET-28a载体上，获得重组载体①，转化E.coli JM109涂布于含有含有卡那抗性的LB固体平板上，培养12h，挑取阳性转化子接种于含卡那 霉素的LB液体培养基中培养12h，提取质粒，进行双酶切验证。验证正确的重组载体送往上 海生工进彳丁测序。
[0019] (3)测序正确的重组载体包藏于-20°c冰箱，命名为重组载体①。
[0020] (4)用步骤（1)(2)(3)中所述同样方法构建重组载体②，引物替换为Fa、Ra(序列分 别如SEQIDN0.5、SEQIDN0.6所示），扩增出目的基因序列为ureEFGD:
[0023] (5)用重组载体②序列设计引物Ft、Rt，扩增出重组载体②上T7启动子至ureEFGD 序列。并利用步骤（1)(2)(3)中所述同样方法构建含有双启动子及酸性脲酶全基因的重组 载体③。
[0024] (6)将重组载体③转化E.coli BL21(DE3)，获得重组E.coli BL21(DE3)。并以1% 的接种量接种于50mL的LB中，其中含卡那霉素50yg/mL，NiS〇4〇.05g/L，尿素1%，37°C、 200rpm培养至0D6qq值0.8~1.0之间，加入IPTG至终浓度0.5mM，25°C、200rpm培养10h。
[0025] (7)将所得发酵液lOOOOrpm离心lOmin，弃上清，细胞沉淀用10mL25mMpH7.0的 PBS缓冲液重新悬浮，超声破碎后，离心收集沉淀，获得脲酶初包涵体。
[0026] (8)将脲酶包涵体用BufferI洗涤一次，用BufferΠ洗涤两次。
[0027] (9)将洗涤后的包涵体用含有8M尿素的Bufferin溶解，离心留上清获得包涵体溶 液。
[0028] (10)将步骤(9)中所得包涵体用镍柱亲和层析进行纯化。流动相A为含20mM咪唑和 8M尿素的Bufferm，流动相B为含500mM咪唑和8M尿素的BufferΙΠ。
[0029] (11)将步骤(10)中的包涵体溶液装入透析袋中，并将透析袋置于尿素浓度为8M- 0M变化的BufferΙΠ中透析。透析时间为6h，透析温度为4°C。
[0030]所述酸性脲酶基因来源于对本实验室筛选菌株普罗维登斯菌JN-B815提取基因组 进行克隆。酸性脲酶结构基因如SEQ ID N0.2所示及辅基基因如SEQ ID NO. 1所示。
[0031] 所述表达菌株为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
[0032] 所获得全亚基酸性脲酶粗包涵体经BufferI、BufferΠ洗涤，以及镍柱亲和层析 进行分离纯化，获得电泳纯的酸性脲酶包涵体。
[0033] 经包涵体纯化复性后所得可溶性酸性脲酶，体现出与原始酶相同的双功能酶活 性。且脲酶与EC降解酶活性比保持原酶一致，约为3:1。此重组脲酶双功能酶活性均高于只 含有结构亚基的重组脲酶，分别为脲酶比酶活l〇.8U/mg，氨基甲酸乙酯降解酶比酶活为 3.4U/mg。脲酶酶活及氨基甲酸乙酯降解酶酶活均测于pH为4.5的缓冲液条件下。
[0034] 酶活测定方法:采用靛酸蓝反应(Berthelot reaction)比色法
[0035]酶活定义:在常压，37°C，pH4.5条件下，每分钟分解底物尿素或氨基甲酸乙酯产生lwnol氨为1个酶活力单位。其中，尿素降解酶和氨基甲酸乙酯降解酶活力的测定分别采用 尿素和氨基甲酸乙酯作为底物。
[0036]本发明提供的脲酶辅基基因能显著提高脲酶的酶活，具有很好的应用前景。此外， 本发明设计了一种合适的方法对脲酶包涵体进行复性。证实了该酸性脲酶同时具有氨基甲 酸乙酯降解酶活性，为酸性脲酶在酒类饮料中的应用提供了优良的基础。
[0037]
[0038]
[0039]
[0040]
【具体实施方式】
[0041] LB(g/L):胰蛋白胨10,酵母膏5，NaCl 10，pH 7.0;
[0042] Buffer I：50mM PBS,lmM EDTA,pH7.0；
[0043] Buffer Π：50mM PBS,lmM EDTA,50mM NaCl ,0.3%TritonX-100,pH 7.0；
[0044] Bufferm:25mM PBS，lmM EDTA，0.2mM GSSG，2mM GSH，20%甘油，1%甘氨酸
[0045]大肠杆菌E.coli JM109(DE3)、E.coliBL21(DE3)和pET-28a载体由本研究室保藏
[0046] T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoR I、Sal I、Not I、Xho I以及共用Buffer、琼脂糖 凝胶电泳Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0047]实施例1重组载体①构建方法。
[0048]为实现酸性脲酶基因在大肠杆菌中的表达，以酸性脲肽酶结构基因ureABC设计一 对基因引物。
[0051 ]下划线表示酶切位点碱基序列。
[0052]以普罗维登斯菌基因组为模板，Fs及Rs为引物扩增目的基因。PCR体系为（50yL): PrimerSTAR酶25yL;基因组lyL;Fs lyL;Rs lyL;ddH20 22μΙ^ΡΟ?条件为：95°C预变性 lOmin; 95°C变性15s，59°C退火30s，72°C延伸3min; 72°C后延伸lOmin; 35个循环。
[0053] 将扩增获得的目的基因与质粒pET_28a用EcoR I和SalI分别单酶切，单酶切体系 如下：
[0054]双酶切体系(40yL)体系：目的基因/质粒12yL，限制酶2yL，双蒸水22yL，Buffer 4μ匕37°(3也〇1? I和Sal I酶切反应6h，胶回收目的条带。
[0055]将双酶切后的目的基因与载体按8:1的比率混合，16°C过夜连接并转化E.coli JM109。涂布于含氨苄抗性（100yg/mL)的LB培养基中培养12-16h。挑取单菌落进行LB摇瓶培 养扩增及双酶切验证，验证正确的进行序列测定，测序正确的即为重组载体①。
[0056]大肠杆菌感受态细胞的制作：
[0057] (1)挑取E.coliJM109单菌落接种到5mL LB试管培养过夜，37°C，200rpm( 10h);
[0058] (2)以1%接种量接到50mLLB三角摇瓶中，37C培养2-3h，至0D_达到0.5左右；
[0059] (3)将菌体转至无菌的，用冰预冷的50mL离心管，在冰上放置lOmin，使培养物冷 却，4°C、4000rpm离心lOmin，弃上清，将管倒置lm