油菜抗旱及ABA耐受相关的蛋白BnSIP1的基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于油菜生物技术领域，涉及一种油菜抗旱及ΑΒΑ耐受相关的蛋白BnSIPI的基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着全球极端气候的频繁出现和人口的累积增长，粮食危机越来越成为全球科学 家和政治家乃至普通民众关心的重要问题，尤其对于像我国这样的农业大国和人口大国而 言，问题更加突出。一直以来，如何提高作物的抗逆性是中国农业科学家最关注的课题。油 菜是我国主要油料作物之一，在国民经济中占有不可取代的地位;然而由于人口增多造成 的耕地面积减少，气候变化导致的非生物胁迫如干旱、淹水和高低温等，都给油菜的生产带 来了严重的负面影响。目前，培育抗逆油菜品种已成为育种学家的重要目标。
[0003]植物中约有60多个转录因子基因家族存在，它们作为一类重要的调控基因，在植 物应答外界逆境胁迫及生长发育等多方面都扮演重要角色，例如目前已被广泛研究的AP2/ EREBP、NAC、bZIP和MYB等转录因子家族。Trihelix转录因子家族是一类最近才被引发关注 的基因家族（Gao，2009 ;Li，2006 ;Lin，2007 ;Fang，2010 ;Willman，2011 ;Ruth，2011)。就基因 数目而言，它们属于转录因子家族里面的一个小家族，据序列预测在拟南芥和水稻中分别 只有30和31个成员，大部分成员的功能未知(Ruth，2011)。除在模式植物拟南芥中有部分 Trihelix转录因子家族成员被克隆外，目前在水稻、大豆、烟草、豌豆等作物中也有少数成 员被克隆，尚未见油菜中该基因家族成员被克隆和功能鉴定的报道。
[0004]Trihe1ix转录因子家族因其在DNA结合结构域含有三个串联的螺旋结构（螺旋-环-螺旋-环-螺旋)而得名，被分为GT-1，GT-2，GTγ，SH4和SIP1亚家族，各亚家族均含有N端Trihelix保守结构域，但C端结构域各不相同。Trihelix保守结构域与MYB转录因子的螺旋-转角-螺旋结构具有类似性，对Trihelix基因家族进行进化分析，推测该家族起源于一个 MYB-like基因，虽然如此，但这两个基因家族的保守结构域还是存在差异，Trihelix保守结 构域每两个螺旋之间插入的氨基酸序列比MYB的要长，这将是导致它们对DNA识别元件不同 的原因（Nagano,2000)。研究认为该基因家族在植物的花、气孔、胚胎和种子的发育中起重 要调控作用，最近的研究还发现部分Trihelix基因家族成员在盐胁迫、干旱胁迫和冷胁迫 等非生物胁迫中扮演重要角色（Park，2004;Yoo,2010;Xie，2009;Fang，2010)。
[0005] BnSIPI基因是本发明开发的一个Trihelix基因家族SIP1亚家族成员之一，SIP1亚 家族成员之前并未被报道参与植物抗逆调节，本发明首次证明该类亚家族成员参与干旱应 答及ΑΒΑ通路调控。
[0006] 参考文献：
[0007]KGao,M-J.et al. (2009)Repression of seed maturation genes by a trihelix transcriptional repressor in Arabidopsis seedlings.Plant Cell21,54-71；
[0008] 2、Li，C.et al.(2006)Rice domestication by reduced shattering.Science 311,1936-1939；
[0009] 3、Lin，Z.et al.(2007)0rigin of seed shattering in rice(0ryza sativa L.).Planta 226,11-20.
[0010] 4、Fang，Y.et al·(2010)Systematic analysis of GT factor family of rice reveals a novel subfamily involved in stress responses.Mol.Genet.Genomics 283,157-169；
[0011] 5、Wi1lman，M·R.et al·(2011)MicroRNAs regulate the timing of embryo maturation in Arabidopsis.Plant Physiol.155,1871-1884；
[0012] 6.Ruth N.et al.(2011)The trihelix family of transcription factors-light^stress and development.Cell press·3，163-171;
[0013] 7>Nagano,Y.(2000)Several features of the GT-factor trihelix domain resemble those of the Myb DNA-binding domain.Plant Physiol.124,491-493；
[0014] 8、Park，H.C.et al·(2004)Pathogen_and NaCl-induced expression of the SCaM_4promoter is mediated in part by a GT-lbox that interacts with a GT_1_ like transcription factor.Plant Physiol.135,2150-2161；
[0015] 9>Yoo,C.Y.et al.(2010)The Arabidopsis GTL1transcription factor regulates water use efficiency and drought tolerance by modulating stomatal density via transrepression of SDD1.Plant Cell 22,4128-4141；
[0016] 10、Xie，Z_M.et al·(2009)Soybean trihelix transcription factors GmGT_2A and GmGT_2B improve plant tolerance to abiotic stresses in transgenic Arabidopsis.PLoS ONE 4,e6898〇
【发明内容】
[0017]本发明的目的是提供一种油菜抗旱及ABA耐受相关的蛋白BnSIPl的基因和及其应 用。
[0018]本发明的目的是这样实现的：
[0019]一、BnSIPl
[0020]核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0021 ]氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0022]二、BnSIPl的来源
[0023]通过比较水培两周大小的甘蓝型油菜中双6号在25%roG6000模拟干旱胁迫前后 的转录谱差异，发现一个与拟南芥Trihelix家族基因具有同源性的油菜未知功能基因在干 旱胁迫4小时后表达量较胁迫前升高4.3倍，经RACE扩增cDNA全长。将测序获得的序列信息 在NCBI上进行Blast分析，发现该基因编码的氨基酸序列与拟南芥Trihelix转录因子家族 中SIP1亚家族成员具有同源性，故将其命名为BnSIPl，其cDNA全长是924bp，编码307个氨基 酸。扩增BnSIPl的cDNA全长序列的特异性引物为：
[0024]上游引物BnSIPl-F序列：ATGGAAGACGGAGAITCTAACC;
[0025]下游引物BnSIPl-R序列：TCAGTITCTCCCAATCCTTAGTG。
[0026]三、BnSIPl的应用
[0027] 1、由氨基酸序列组成的蛋白质的应用:调控植物的抗旱性。
[0028] 2、由氨基酸序列组成的蛋白质的应用:调控植物对ΑΒΑ的耐受性。
[0029] 将所述核苷酸序列如SEQIDNO. 1或编码蛋白质序列如SEQIDΝ0.2所示的基因 BnSIPl转入油菜组织，培育出耐旱性油菜。
[0030] 四、工作机理
[0031]本发明应用了植物基因工程技术，首次从油菜克隆了与油菜抗旱及ΑΒΑ耐受相关 基因BnSIPl，通过实时荧光定量PCR检测，其结果表明，所述基因BnSIPl的表达受到了干旱 胁迫的调节，在油菜的萌发期及苗期都能产生影响，且在胁迫的早期和晚期都起到作用;所 述基因BnSIP1的表达受ΑΒΑ的调节，说明BnSIP1是通过ΑΒΑ依赖的信号转导途径参与了油菜 对干旱胁迫的响应，改善干旱胁迫下叶片叶绿素含量;BnSIPl参与油菜抗旱及ΑΒΑ耐受机制 的挖掘为该基因在油菜抗旱育种中的利用提供了更为可靠的证据。
[0032]本发明具有如下优点和积极效果：
[0033]①BnSIPl是油菜中第一个被克隆和进行功能鉴定的Trihelix家族基因，其在模式 植物拟南芥中的同源基因AT3g54390也属于功能未知基因，所以，对此新基因功能的挖掘使 得本发明具有很强的原创性，进一步扩充了油菜优良基因资源，为推进油菜功能基因组学 的发展奠定了实验基础；
[0034]②BnSIPl同时具有提高抗旱和ΑΒΑ耐受的功能，是一个重要的多效调控基因，一方 面拓宽了对Trihelix基因家族的理论认识，另外一方面加深了对植物在逆境胁迫响应机制 和ΑΒΑ调控网络两个信号通路之间可能存在的"crosstalk"的认识，进而为在实际生产中 培育抗逆油菜新品种提供理论基础。
[0035]③BnSIPl在干旱胁迫和ΑΒΑ响应机制方面的功能，将预示本发明的应用将有助于 改良植物的抗旱胁迫能力，对我国农业生产具有重要应用价值。
【附图说明】
[0036]图1为BnSIPl基因编码蛋白质结构域特征及与同源蛋白比对结果图片，
[0037] A:BnSIPl基因编码蛋白质结构域特征，
[0038] B:BnSIPl基因编码蛋白质与同源蛋白比对结果；
[0039] 图2为GFP融合BnSIPl基因的亚细胞定位图片，
[0040] A-C:BnSIPl基因定位于细胞核，D-F:GFP空载体对照；
[00411图3为BnSIPl基因在油菜中的组织表达特异性分析图片，纵坐标为BnSIPl基因表 达量，横坐标代表油菜中双6号各个组织；
[0042] 图4为BnSIPl基因在50mMABA，200mMNaCl，和600mM甘露醇处理下不同时间点(0， l，2,4,8，12,24h)表达水平变化图图片；
[0043]图5为BnSIPl基因过表达转基因油菜分子鉴定结果图片，纵坐标为BnSIPl基因表 达量，横坐标为野生型植株及过表达植株。
[0044]图6为BnSIPl基因过表达转基因油菜干旱处理结果图片，
[0045] A: 15天幼苗在正常生长条件及600mM甘露醇处理6h条件下，野生型与BnSIPl基因 过表达转基因油菜生长观察；
[0046] B: 15天幼苗在正常生长条件及300mM甘露醇处理条件下生长9天，野生型与BnSIPl 基因过表达转基因油菜生长观察；
[0047] C:正常生长条件及300mM甘露醇处理9天后野生型和BnS