专利名称：：球状芽孢杆菌及其所产耐有机溶剂稳定性蛋白酶的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种从中国黄海连云港海域的海水中分离得到球状芽孢杆菌DS11(Sflc/〃w^;zaeWc^DS11);本发明还涉及该球状芽孢杆菌产有机溶剂稳定性蛋白酶的方法与产品。
背景技术：
：蛋白酶可以在水相催化肽键的水解，在有机相条件下催化肽键的合成，是目前最广泛的酶制剂之一，广泛应用于多肽合成、蛋白质加工、食品、制药、制革及洗涤剂等领域。蛋白酶在有机相催化肽合成时，要求蛋白酶耐受有机溶剂。但是，有机溶剂对大多数酶类具有较强的毒害作用。通过酶的化学修饰、包埋、固定、蛋白质工程和定向进化等手段可以提高酶对有机溶剂的耐受性。但是这些方法成本高、操作复杂，如果酶在有机溶剂存在的情况下具有高活性和稳定性，可以大大简化工序，降低成本。耐有机溶剂极端微生物是可以在较高浓度有机溶剂存在的环境中生长繁殖的一类微生物。耐有机溶剂极端微生物往往产生有机溶剂稳定性酶类，如脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶。因此筛选耐有机溶剂极端微生物成为获得有机溶齐U禾急定性酶的主要手段。目前只发现尸化wdcw20"osaerag/"o^禾BSacz'〃wsp.可以产生耐有机溶剂蛋白酶。且并没有进行工业化生产，难以满足市场的需要。国内关于耐有机溶剂微生物及有机溶剂酶稳定性类研究报道较少，目前国内尚没有球状芽孢杆菌产有机溶剂稳定性蛋白酶的报道。筛选新型的有机溶剂稳定性蛋白酶，对于丰富有机溶剂稳定性蛋白酶种类，满足工业化生产需要和研究蛋白酶有机溶剂稳定性机制奠定基础。
发明内容本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种通过球状芽孢杆菌(&"7/m^/weWcusDSll)DS11来生产有机溶剂稳定性蛋白酶的方法。本发明还公开了上述方法所产有机溶剂稳定性蛋白酶的性质。本发明还公开了球状芽孢杆菌(Sac/〃ws^/wen'cusDSll)DSll的分离培养方法。本发明中所涉及的生物材料球状芽孢杆菌DS11(5ac/〃m^/zaen'cusDSll)菌株是一种公开的菌株，已于2008年8月4日在Genebank公开，该菌株的16SrDNA序列也己在Genebank公开，其长度为1467bp，登录号为EU835735,网址为http:〃www.ncbi.nlm.nih.g;ov/entrez/viewer.fcg:idb=nuccore&id=194716764。该菌株为公知公用材料，在该专利申请日起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。本发明是在上述公开的球状芽孢杆菌DSll(&c/〃us^/wen'cwDS11)菌株的基础上研究其产机溶剂稳定性蛋白酶及产酶方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种球状芽孢杆菌DSll(Bflc/〃w^/wen'cwDS11)，其特点是，它采用以下方法进行分离培养，将取自中国黄海连云港海域的海水水样1ml添加到250ml三角瓶装有50mL含10。/。苯的MLB液体培养基中，用橡胶塞塞住瓶口，28°C，160r/min培养4d后转接到新的MLB液体培养基中，如是3次；将所得培养液稀释105倍后，吸取IO涂布MLB培养基平板，在28t:培养箱中培养2d，观察菌落形态，划线纯化至纯种后点种于SMA培养基平板，在28°C培养箱中培养2d，初步筛选出菌落直径与透明圈直径的比值大于5的菌株，并将初筛菌株分别接种到产酶发酵培养基，28°C，180r/min培养48h后，4。C下8000g离心10min，测定上清液蛋白酶活性；分别取1mL上清液加入lmL苯，在30。C，180r/min振荡处理1h后检测蛋白酶活力，苯处理前后蛋白酶活性降低最小的菌株即为球状芽孢杆菌DS11(&"7/ms/Aaer/cMSDS11)。以下的发明人所做的关于菌株的鉴定。l.l形态特征革兰氏阳性、短杆状、大小为2.2-2.7iimx0.7-1.3pm、无荚膜、有芽孢。1.2在脱脂乳(SMA)固体培养基上的菌落特征直径2mm-4mm，白色、湿润、边缘光滑、中间突起、易挑取，产生明显的透明圈。1.3生理生化特征生理生化特征该菌过氧化氢酶、脲酶、MR试验均为阳性，氧化酶、VP试验为阴性，不能产生吲哚，不产生H2S;可以水解凝胶、吐温_80、三油酸甘油酯、酪蛋白，不能水解淀粉。菌株DS11可以利用葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露醇，不能利用麦芽糖、乳糖、棉籽糖、鼠李糖、丙二酸为碳源。通过Bergey，sManualofSystematicBacteriology分析鉴定球状芽孢杆菌DS11。ac!7/ww/^er/cMDS11)属于^^///wSp.初步鉴定该菌为菌球状芽孢杆菌(5ac/〃ws//z)。1.4生长特征菌株的生长温度范围为4-36。C，最适生长温度为28。C(图l);生长pH范围为4-11，最适生长pH为7(图2);生长的NaCl浓度为0.3%-10°/。，最适NaCl浓度为3%(图3)。可以耐受极性常数(LogP)低于等于2.0的有机溶剂。表1菌株DS11的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>"+"为阳性，"一"为阴性，1.4菌株DSll的分子生物学鉴定16SrDNAPCR扩增和序列分析用Takara试剂盒提取DNA模板，并于-40。C保存。正向引物P1:5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物P2:5'-CGGCTACCTTGTTACGAC-3'。反应体系50^1，Taq酶2U，反应条件为94。C预变性5min，94。C变性30s，54。C退火40s，72。C延伸lmin，35个循环，72'C延伸7min。PCR产物的纯化、克隆、测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。扩增菌株GS230的16SrDNA，其长度为1467bp。将该序列递交GenBank(登录号EU835735)并与GenBank数据库中的序列进行同源性比较，发现菌株DSll与5acz7/w的16SrDNA自然类聚。选择与其同源性高的菌株与DS11进行系统发育的构建，得出菌株DS11与S"a7/us^/zfleho^(16SrDNAGenBank登录号AB116123)亲缘关系最近，进一步鉴定该菌株为球状芽包杆菌5a"'〃wss//2fler/cws。关于本发明菌株产有机溶剂稳定性蛋白酶的方法。1.1本发明中相关培养基脱脂乳(SMA)固体培养基(g/L):蛋白胨5.0，酵母粉3.0，脱脂奶粉25.0，琼脂40，陈海水1000.0ml，pH7.0。MLB液体培养基(g/L):蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl10.0，MgSO4'7H2O0.5，pH7.0。MLB固体培养基(平板)(g/L):蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCllO.O，MgSO4'7H2O0.5，琼脂40，pH7.0。产酶发酵培养基(g/L):蛋白胨10.0，(NH4)2S041.0，KH2P040.5;MgSO4.7H2O0.3，CaCl2.2H201.0，NaCl1.0，甘油10.0ml，pH7.0。1.2发酵产酶将球状芽孢杆菌DSll(^^///w";;/7aeWa^DS11)菌株接种到MLB液体培养基，180r/min，28。C培养24h作为种子液，将种子液以1%的接种量接种于产酶发酵培养基，180r/min，28。C培养32h，10,000g离心20min后所得上清液过0.22pm滤膜即为有机溶剂稳定性蛋白酶粗酶液。关于球状芽孢杆菌DSll(Bac77/wsw/2aen'cwDS11)菌株的有机溶剂耐受性。将球状芽孢杆菌DS11(Bac!7/wss;/zaer/cwsDS11)菌株接种到MLB固体培养基平板，平板上覆盖7.0ml不同极性常数的有机溶剂，用保鲜膜封好防止有机溶剂挥发，28'C培养48h，观察菌株生长情况。结果表明，球状芽孢杆菌DSII(5ac/〃M^/aen'cwDS11)可以在极性常数不大于2的有机溶剂覆盖的平板上生长，形成菌落。见表2。表2有机溶剂对菌株生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>关于有机溶剂对有机溶剂稳定性蛋白酶稳定性的影响。1、有机溶剂对有机溶剂稳定性蛋白酶稳定性的影响。将3.0ml粗酶液中加入不同极性常数的有机溶剂添l.Oml，30'C,140r/min,14d后，结果表明，甲醇、乙醇、1-丁醇处理后的剩余酶活分别1为原酶活的35%、36%和42%;在苯、二甲苯、己烷、正己烷中保持82%以上的酶活性；正癸垸、辛烷、异辛烷、庚垸等可以提高了酶的活性。见表3。表3有机溶剂对蛋白酶稳定性的影响有机溶剂LogP相对酶活(％)对照-100正癸烷5.6142辛烷4.9158异辛烷4.5136庚烷4.0125正己烷3.596二甲苯3.198甲苯2.598苯2.092己醇1.882l-丁醇l0.842乙醇-0.2436甲醇-0.76352、有机溶剂稳定性蛋白酶活性测定。将2.0ml含2%(w/w)酪蛋白的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)和2.0ml稀释的粗酶液37。C预热10min后混合均匀，37"C恒温水浴反应10min，加入4.0mlTCA溶液(0.11M三氯乙酸，0.22M乙酸纳，0.33M乙酸)，4。C放置20min后，15，000g离心15min，上清液测定280nm光吸收值，在测定条件下，每分钟催化产生lpg酪氨酸的酶量定义为1个酶活单位(U)。3、有机溶剂稳定性蛋白酶的应用。本发明球状芽孢杆菌DSll(Bw///^^/2^n'c^DS11)菌株所产有机溶剂稳定性蛋白酶的耐受有机溶剂的能力较强，它和其它公知的有机溶剂稳定性蛋白酶一样，可以用于有机相高效催化多肽的合成。图l为温度和时间对菌株生长的影响图。图2为初始pH对菌株生长的影响图。图3为NaCl对菌株生长的影响图。具体实施例方式实施例l。球状芽孢杆菌DSll(5ac/〃w^/wen'c^DS11)菌株的分离培养。将取自中国黄海连云港海域的海水水样lml添加到250ml三角瓶装有50mL含10。/。苯的MLB液体培养基中，用橡胶塞塞住瓶口，28°C，160r/min培养4d后转接到新的MLB液体培养基中，如是3次；将所得培养液稀释105倍后，吸取10pl涂布MLB培养基平板，在28"C培养箱中培养2d，观察菌落形态，划线纯化至纯种后点种于SMA培养基平板，在28°C培养箱中培养2d，初步筛选出菌落直径与透明圈直径的比值大于5的菌株，并将初筛菌株分别接种到产酶发酵培养基，28°C，180r/min培养48h后，4。C下8000g离心IOmin，测定上清液蛋白酶活性；分别取lmL上清液加入lmL苯，在30°C，180r/min振荡处理lh后检测蛋白酶活力，苯处理前后蛋白酶活性降低最小的菌株即为球状芽孢杆菌DS11(—ae"'cusDS11)。实施例2。球状芽孢杆菌DSll(Sa"7/w^/7aen'c^DS11)菌株特征。该菌株为革兰氏阳性、短杆状、大小为2.2-2.7(xmx0.7-1.3^im、无荚膜、有芽孢。在脱脂乳(SMA)固体培养基上的菌落直径2mm-4mm，白色、湿润、边缘光滑、中间突起、易挑取，产生明显的透明圈。该菌过氧化氢酶、脲酶、MR试验均为阳性，氧化酶、VP试验为阴性，不能产生吲哚，不产生H2S;可以水解凝胶、吐温一80、三油酸甘油酯、酪蛋白，不能水解淀粉。菌株DS11可以利用葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露醇，不能利用麦芽糖、乳糖、棉籽糖、鼠李糖、丙二酸为碳源。实施例3。球状芽孢杆菌DS11(万ac/〃w5p/wen'cwsDS11)菌株耐有机溶剂特性研究。将实施例l所述的球状芽孢杆菌DS11接种到MLB固体培养基平板，平板上覆盖7.0ml不同极性常数的有机溶剂，用保鲜膜封好防止有机溶剂挥发，28t:培养48h，菌株DS11可以在极性常数不大于2的有机溶剂覆盖的平板上生长，形成菌落。实施例4。球状芽孢杆菌DSll(Sac/〃w^/2aeWc^DS11)产有机溶剂稳定性蛋白酶的方法。将实施例l所述的球状芽孢杆菌DSll(5ac/〃^^/weWcwDS11)菌种接种到MLB液体培养基，180r/min，28"C培养24h作为种子液，将种子液以1%的接种量接种于产酶发酵培养基，180r/min，28"培养32h，10,000g离心20min后所得上清液过0.22[im滤膜即为有机溶剂稳定性蛋白酶粗酶液。实施例5。有机溶剂对实施例4所述有机溶剂稳定性蛋白酶稳定性的影响。取有机溶剂稳定性蛋白酶粗酶液用25%(V/V)不同极性常数的有机溶剂30。C,140r/min,处理14d后，甲醇、乙醇、1-丁醇处理后的剩余酶活分别为原酶活的35%、36%和42%;在苯、二甲苯、己垸、正己烷中保持82%以上的酶活性；正癸垸、辛垸、异辛烷、庚烷等可以提高了酶的活性。权利要求1.一种球状芽孢杆菌DS11(BacillussphaericusDS11)，其特征在于，它采用以下方法进行分离培养，将取自中国黄海连云港海域的海水水样1ml添加到250ml三角瓶装有50mL含10％苯的MLB液体培养基中，用橡胶塞塞住瓶口，28℃，160r/min培养4d后转接到新的MLB液体培养基中，如是3次；将所得培养液稀释105倍后，吸取10μl涂布MLB培养基平板，在28℃培养箱中培养2d，观察菌落形态，划线纯化至纯种后点种于SMA培养基平板，在28℃培养箱中培养2d，初步筛选出菌落直径与透明圈直径的比值大于5的菌株，并将初筛菌株分别接种到产酶发酵培养基，28℃，180r/min培养48h后，4℃下8000g离心10min，测定上清液蛋白酶活性；分别取1mL上清液加入1mL苯，在30℃，180r/min振荡处理1h后检测蛋白酶活力，苯处理前后蛋白酶活性降低最小的菌株即为球状芽孢杆菌DS11(BacillussphaericusDS11)。2.根据权利要求1所述的一种球状芽孢杆菌DSll(5ac/〃w^/^en'cwDS11)，其特征在于，所得球状芽孢杆菌DSll(Bac/〃w^/wen'cwDS11)菌株具有以下特征1)生长特征菌株的生长温度范围为5-45°C，最适生长温度为28°C;生长pH范围为4-11，最适生长pH为7;生长的NaCl浓度为0.3%-10%，最适生长的NaCl浓度为3%;2)菌体特征革兰氏阳性、短杆状、大小为2.2-2.7^imx0.7-1.3pm、无荚膜、有芽孢；3)在脱脂乳固体培养基上的菌落特征直径2mm-4mm，白色、湿润、边缘光滑、中间突起、易挑取，产生明显的透明圈;4)生理生化特征该菌株过氧化氢酶、脲酶、MR试验均为阳性，氧化酶、VP试验为阴性，不能产生吲哚，不产生H^;可以水解凝胶、吐温一80、三油酸甘油酯、酪蛋白，不能水解淀粉；可以利用葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露醇，不能利用麦芽糖、乳糖、棉籽糖、鼠李糖、丙二酸为碳源。3.根据权利要求1所述的一种球状芽孢杆菌DSll(Sa"'〃M^/2aw/cwDS11)，所得球状芽孢杆菌DSll(万"c/〃w^/zaen'c^DS11)菌株在MLB固体平板上可以耐受极性常数不大于2.0的有机溶剂。4.一种如权利要求1-3中任何一项所述的球状芽孢杆菌DS11(5acz7/w^/7"w/cwDSll)产有机溶剂稳定性蛋白酶的方法，其特征在于，其步骤如下，将球状芽孢杆菌DSll(Bac/^Mp/wen'cuyDSll)接种到MLB液体培养基中，180r/min，28。C培养24h，作为种子液；将种子液以1%的接种量接种于产酶发酵培养基，180r/min，28'C培养32h，10，000g离心20min后所得上清液过0.22pm滤膜即得有机溶剂稳定性蛋白酶粗酶液。5.—种如权利要求4所述的方法所产有机溶剂稳定性蛋白酶，其特征在于，所述的有机溶剂稳定性蛋白酶具有以下性质，向粗酶液中加入25%不同的有机溶剂，30。C,140r/min，14d后，甲醇、乙醇、1-丁醇处理后的剩余酶活分别为原酶活的35%、36%和42%;在苯、二甲苯、己垸、正己烷中保持82%以上的酶活性；正癸垸、辛垸、异辛烷、庚烷可提高了酶的活性。全文摘要本发明是一种球状芽孢杆菌DS11(BacillussphaericusDS11)。该菌株为短杆状革兰氏阳性菌，菌株的生长温度范围为4-35℃，最适生长温度为28℃；生长pH范围为4-11，最适生长pH为7；生长的NaCl浓度为0.3％-10％，最适NaCl浓度为3％。可以耐受极性常数(LogP)不大于2.0的有机溶剂。本发明还公开了一种利用上述球状芽孢杆菌产有机溶剂稳定性蛋白酶的方法及按该方法得到的有机溶剂稳定性蛋白酶产品。该蛋白酶耐受有机溶剂的能力较强，可以用于有机相高效催化多肽的合成。文档编号C12N9/54GK101407778SQ20081023445公开日2009年4月15日申请日期2008年11月19日优先权日2008年11月19日发明者姝刘,吕明生,房耀维,朱广超,王淑军申请人:淮海工学院