稳定的蛋白酶组合物的制作方法

专利名称：：稳定的蛋白酶组合物的制作方法稳定的蛋白酶组合物发明领域本发明涉及一种酶组合物，其中通过在本发明的组合物中的一些添加物稳定该酶。更具体地，本发明涉及一种丝氨酸蛋白酶组合物,包含丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂和如下定义的附加的稳定剂M。技术背景丝氨酸蛋白酶是一类蛋白水解酶，其特征在于在它们的活性位点上具有丝氨酸和组氨酸残基。很多众所周知的酶都属于此类，例如胰蛋白酶、激肽释放酶、凝血酶和纤溶酶。已经发现它们中的一些的实际应用。胰蛋白酶用于皮革工业。凝血酶用作止血剂以阻止伤口出血。另外两种丝氨酸蛋白酶一尿激酶和组织纤维蛋白溶酶原激活剂在临床上用作血栓溶解剂，用于治疗急性心肌梗塞。很多这样的酶已经广泛地用作研究工具，例如在蛋白质结构确定中。此外，这些酶可以在很多诊断试剂盒中使用。对于大多数的丝氨酸蛋白酶，它们在溶液中的稳定非常有限，这主要是由于当保留在溶液中时它们由于蛋白酶的性质会发生自降解。当必须要把材料贮存在溶液中时，有限的稳定就是一个问题。现在可用的商业丝氨酸蛋白酶制剂主要都是冷冻溶液或冻干粉末，它们具有显而易见的缺点。溶解粉末或将冷冻溶液融化至适当的温度所需的额外时间是最重要的问题。但是，这些制剂还有其他的问题。对于冷冻溶液，在制造和运输到贮存的所有步骤中都需要控制温度(-2(TC)。对于冻干粉末，需要重新生成的溶液具有可接受级别的纯度和稳定。同时，该材料通常需要在非可控(例如严酷天气或缺少清洁水供应)的环境中无菌制备(通过将这两部分混合)，需要检验粉末是否已经适当混合。这些都是当前可用的产品的主要缺点，另外它们使用复杂并且成本较高。对于优选在阻止出血中必须立即使用的凝血酶，稳定问题迫使生产商必须使用冻干的凝血酶或深度冷冻的溶液。然后，需要一定的时间制备才能进行使用。两种血栓溶解剂一尿激酶和组织纤维蛋白溶酶原激活剂都是以冻干制剂的形式出售，它们必须在使用前溶解。由于必须在梗塞开始后尽可能早地开始急性心肌梗塞的血栓溶解治疗，这些制剂产生的任何时间延迟都会成为问题。已经做出很多的努力来发现稳定各种丝氨酸蛋白酶的方法。对于会相当快地自降解的胰蛋白酶，一种简单和有效的稳定剂是钙离子(SiposT和MerkelJ，Biochemistry9:2766(1970))。将pH降低到4以下也是处理一些酶例如胰蛋白酶和纤溶酶的方法，但不适用于凝血酶，这是因为它在pH小于5时会不可逆地失活。可以使用可逆的蛋白酶抑制剂，但是并不通行，因为当使用它们本身时，它们会以有害的方式干扰酶的作用(见下文)。为了稳定组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)，一般使用的方法是加入氨基酸一精氨酸。现在临床使用的tPA材料包含精氨酸作为稳定剂。同时，做了很多努力来发现稳定凝血酶溶液的方法。作为稳定添加物的例子，建议了下列的材料高浓度的羧酸、EDTA、各种氨基酸、白蛋白、聚合物例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇、甘油、各种无机盐、糖类、明胶、胶原。日本专利申请JP2004191367描迷了包含试验试剂的稳定的凝血酶，用于试验血凝结能力。该试验试剂包含凝血酶和凝血酶抑制剂，也可以包含一种或多种稳定凝血酶的化合物，选自钓离子、有机酸、表面活性剂和蛋白质。W002/100830、W002/22575、W000/20394、W099/11658、W002/37937和US5,409,927都描述了不同的丝氨酸蛋白酶抑制剂化合物及它们在制备治疗各种疾病情况，例如血栓形成中的应用，其中指出了抑制相应的丝氨酸蛋白酶。Nakamura等人(/.C力層.A1009,(2003)，133-139)描述了固定的蛋白酶抑制剂在胰蛋白酶-样蛋白酶的亲和色语中的应用。Turner等人Cff/oc/e/z//"/r，25,(1986)，4929-4935)描述了三种对-脒基苯基酯，它们不可逆地抑制人的因子IXa。TsungFuYang等人("/謹cr婦/ecw/es,25，(2004),1926-1932)描述了阳离子型聚合物N，N-二乙基乙二胺聚氨酯的合成，该聚合物可以用于基因递送。US专利申请2001/0033837(对应于EP1136084Al)描述了一种凝血酶制剂，包含非共价结合的抑制剂作为稳定剂。此外，该抑制剂与其他稳定添加物例如糖或羧酸组合，以前在专利和其他出版物中已经描述了这些稳定添加物。JP200030025Q描述了凝血酶溶液的稳定，包括在不同的緩冲溶液中加入聚乙烯醇、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。在GB1354761中，通过很多的材料，例如脂肪醇、羧酸、包含幾基的杂环化合物和脂肪或脂环胺可以不同程度地稳定蛋白酶和淀粉酶o这样，已经描述了使用抑制剂来稳定丝氨酸蛋白酶(例如US2001/0033837和JP2004191367,J:义)。该方法的问题在于，如果在使用该制品前不除去，那么抑制剂就会强烈地减弱酶的效果。如果使用有效的抑制剂，大多数的酶活性都会丧失。一种较好的方法是使用中等强度的可逆抑制剂。但是，甚至在该情况下，相当部分的酶起始活性仍然会丧失，因为需要提高抑制剂的浓度以得到良好的稳定效果。
发明内容因此本发明的一个目的是完成一种丝氨酸蛋白酶组合物，它在溶液中是稳定的，并且保持酶活性至足以实际使用该组合物的程度。本发明的另一个目的是提供一种丝氨酸蛋白酶组合物，它能够直接使用而不需要由深度冷冻或冻干材料制备的前步骤。本发明的一个进一步的目的是通过提供其他的稳定组分使得丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂就稳定目的而言的实际使用成为可能。通过所要求保护的本发明的不同方面可以实现本文中显而易见的这些和其他目的。因此，本发明的一个方面提供一种稳定的丝氨酸蛋白酶组合物，包含a)丝氨酸蛋白酶；b)所述丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂；和c)具有式I的稳定剂M:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>选自H，-CH广R6，-CH广O-R6，-CH厂S-R6，-C0-NH-R6，-CH广NH-C0-R6,-CH2-0-CO-R6，-CH2-NH-C0-0R6，-CH2-NH-CS-NHR6和其中n是0，1或2;X是0，N或CH2;R1-114相同或不同-CH广NH-R6，-CO-O-R6，-CH广NH-CO-NHR6,-CH2-0-CO-NHR6;R5是RLR4或P-Q;P选自-(CH2)f和-(CH上-Y-(CH2)m-，其中m是l-6且Y是0，NH或S;Q选自H，-S03，-COOH，-NH2,—OH和-CONHs;R6各自独立地选自H，取代或未取代的低级烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的苯曱基，取代或未取代的芳基或单-，二-，或三环的具有一个或多个杂原子的未取代或取代的杂芳环和非芳香杂环，所述取代的基团的取代基选自低级烷基、闺素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂-芳香化合物、非芳香杂环、烷氧基、烷氨基；或其药学可接受的盐。本发明最初起源于对凝血酶稳定性的研究，其中令人惊奇地发现，该酶的可逆抑制剂和如上定义的本发明的稳定剂M的组合对于溶液中的酶具有强烈的稳定作用。凝血酶抑制剂和稳定剂M单独使用时对凝血酶都具有稳定作用，但是组合要比它们中的任一种都好数倍(见实施例l)。因此，当低浓度的酶抑制剂与吗啉、MOPS或相关的化合物组合时，获得了对酶非常强的稳定作用。一些受试组合物是稳定的，如所示，当在37'C下2个月以上时，活性只降低了不到30%。根据先有文献和本发明人证实的数据，在室温下对应地是6个月，或在冷藏温度下是2.5年。初期研究的结果可以扩展到包括其他丝氨酸蛋白酶的试验，在这些试验中，也观测到了令人惊奇的稳定作用。如下所例举，与不含本发明的成分b)和c)的组合的酶组合物相比，根据本发明的组合物显示了极大改善的稳定性。当使用本发明的方法时，可以使用低浓度的丝氨酸蛋白酶抑制剂，获得的稳定仍然达到了令人满意的程度。例如，抑制剂的浓度可以低于先前例如US2001/0033837中所建议的浓度。当使用如此低浓度的抑制剂时，在稳定的酶溶液中保持了大得多的酶活性。应当注意的是，由可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂和稳定剂M的组合导致的使稳定增强不应当被视为是M所提供的附加的抑制作用。实际上，如在说明性实施例A中所述，M缺乏对任何丝氨酸蛋白酶的抑制能力。不希望受到理论的束缚，本发明人相信，所观测到的令人惊奇的稳定作用增强是通过本发明的组合物中可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂和稳定剂M之间有利的协同作用而实现的。本发明提供了在稳定的丝氨酸蛋白酶组合物中可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂和稳定剂M的组合，及该组合在稳定丝氨酸蛋白酶组合物中的应用。在本发明的一个实施方案中，该组合物中的丝氨酸蛋白酶选自胰蛋白酶、激肽释放酶、凝血酶、纤溶酶、尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、IX因子的活化形式、X因子的活化形式和XI因子的活化形式。在一个更具体的实施方案中，丝氨酸蛋白酶是凝血酶。在另一具体的实施方案中，丝氨酸蛋白酶是纤溶酶。在另一具体的实施方案中，丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶。丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂是本领域技术人员已知的，优选使用的抑制剂根据所使用的具体丝氨酸蛋白酶而各异。一般地，对于所期望的效果，重要的是抑制剂强度不大。换句话说，抑制作用必须足够适度，以使酶活性有效地保持在高水平。作为指导，已经发现，在根据本发明的组合物中使用时抑制剂的Ki为0.01mM到2mM是适当的，优选的范围是0.04mM到0.5mM。在一个实施方案中，其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制剂可以选自N-(2'-苯氧基)-4-氨基吡啶及其衍生物、苯曱脒、N，N-二乙基乙二胺、氨基苯曱脒、脒基吡啶和叔丁基脒。在另一个实施方案中，其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制剂选自N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶及其衍生物、N，N-二乙基乙二胺、脒基吡啶和叔丁基脒。在一个更具体的实施方案中，其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制剂是N-(2'-苯氧基)-4-氨基吡啶或其衍生物。在另一个实施方案中，其中丝氨酸蛋白酶是纤溶酶，可逆抑制剂选自N，N-二乙基乙二胺、氨基苯曱脒和苯甲脒。在另一个实施方案中，其中丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶，可逆抑制剂选自氨基苯曱脒和苯甲脒。这些酶和抑制剂的组合都是示例性的例子，并不能解释为限制。在本发明的一个实施方案中，式I中n的值是1或2。在一个更具体的实施方案中，式I中n是l。根据本发明的组合物包含具有上述通式I的稳定剂M。在本发明的实施方案中，稳定剂M是式II的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(II)其中或S;RLr4相同或不同，选自h、-ch-R6;f是IH或P-Q;P选自-(CH丄-和-(CH2)m-Y-(CH2)-，其中m是l-6且Y是0、NHQ选自H、-S03、-C00H、-NH2、-OH和-C0NH2;R6各自独立地选自H、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的苯曱基、取代或未取代的芳基或单-、二-、或三环的具有一个或多个杂原子的未取代或取代的杂芳环和非芳香杂环，所述取代的基团的取代基选自低级烷基、卣素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂-芳香化合物、非芳香杂环、烷氧基、烷氨基；或其药学可接受的盐。因此，在一些实施方案中，稳定剂M是式III的化合物r^、SA5an)其中R5是-CH广R6或P-Q;P选自-(CH丄-或-(CH2h-Y-(CH上-，其中m是l-6且Y是0、NH或S;Q选自H、-S03、-COOH、-NH2、-OH和-C0冊2。R6各自独立地选自取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的苯甲基、取代或未取代的芳基、所述取代的基团的取代基选自低级烷基、囟素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂-芳香化合物、非芳香杂环、烷氧基、烷氨基；或其药学可接受的盐。在本发明的一些实施方案中，稳定剂M选自吗啉，3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)，吗啉代丁基磺酸，吗啉代丙基羧酸，吗啉代乙基醇和吗啉代乙基磺酸。因此，在本发明的这个方面的组合物中使用的化合物M的例子是吗啉和3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)。在本发明的一个具体的实施方案中，稳定剂M是吗啉。根据本发明显示稳定作用的组合物是，其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制剂是N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶，稳定剂M是吗啉。根据本发明显示稳定作用的另一组合物是，其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制剂是N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶，稳定剂M是3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)。根据本发明显示稳定作用的另一组合物是，其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制剂是氨基苯曱脒，稳定剂M是吗啉。根据本发明显示稳定作用的另一组合物是，其中丝氨酸蛋白酶是纤溶酶，可逆抑制剂是N，N-二乙基乙二胺，稳定剂M是吗啉。根据本发明显示稳定作用的另一组合物是，其中丝氨酸蛋白酶是纤溶酶，可逆抑制剂是氨基苯甲脒，稳定剂M是吗啉。在局部例如在创伤位点给药的丝氨酸蛋白酶组合物中，现有的问题在于，该组合物容易流动或从所使用的位点沖洗走。为了解决这个问题，可以向该酶组合物中加入粘附性聚合物，这样就达到了使该组合物对皮肤或创伤位点更有粘性和粘附性的目的。作为本发明的一个实施方案，向本发明的组合物中加入粘附性聚合物对其稳定具有额外的预料不到和有益的效果。这样，加入聚合物就达到了双重的目的，既增强了组合物的粘性和粘附性，同时甚至进一步有助于酶的稳定。在本发明的一些实施方案中，该组合物进一步包含选自多糖和明胶的粘性和粘附性聚合物。这样，该聚合物可以例如是多糖，例如选自淀粉，其衍生物，纤维素，其衍生物及其混合物。具体地，可以在根据本发明的组合物中用做添加物的淀粉的非限制性例子包括玉米淀粉和马铃薯淀粉及其混合物，而有用的纤维素衍生物非限制性例子是羧甲基纤维素和乙基羟乙基纤维素及其混合物。在一个具体的实施方案中，多糖是羧甲基壳聚糖。在本发明的进一步的实施方案中，所述多糖的浓度是Q.1-5%。但是，还设想该聚合物是明胶，例如来自冷水鱼的明胶。在本发明的一些实施方案中，所述明胶的浓度是0.5-20%。在本发明的一个实施方案中，所述丝氨酸蛋白酶的浓度是0.001-2mg/ral。在一个更具体的实施方案中，所述丝氨酸蛋白酶的浓度是0.01-1rag/ml。在本发明的一个实施方案中，其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶，凝血酶的浓度是5-3500活性单位/ml。在本发明的一个实施方案中，其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶，凝1血酶的浓度是200-1000活性单位/ml。在本发明的一个实施方案中，其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶，凝血酶的浓度是5-20活性单位/ml。在本发明的一个实施方案中，所述丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂的浓度是0.1-10mM。在一个更具体的实施方案中，所述丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂的浓度是0.5-2mM。在本发明的一个实施方案中，所述稳定剂M的浓度是0.02-0.5M。在一个更具体的实施方案中，所述稳定剂M的浓度是0.1-0.3M。根据另一个方面，本发明提供如上所述的组合物作为药物的应用。本发明的另一个方面关注其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶的所述组合物在制备实现给出血患者止血的药物中的应用。本发明一个相关的方面提供一种实现给出血患者止血的方法，包括以足以减少或停止所述出血的量在出血位点上使用本发明的组合物，其中该组合物中丝氨酸蛋白酶是凝血酶。在使用根据本发明的凝血酶组合物作为药物的应用或方法方面，本发明的组合物的稳定性在其所使用的条件下提供了益处。通常，凝血酶组合物是在急诊的情况中使用，其中关键是阻止患者出血。在相同的情况中，使用常规的止血凝血酶制剂是极为困难的，因为它们通常需要麻烦和消耗时间的步骤，即融化(如果是冷冻)和/或溶解(如果是冻干)。本发明能够生产溶液形式的止血剂，它们的稳定使得它们在较长的时间里例如在救护车或急诊的直升飞机中易于贮存，直至在事故或类似问题发生的位点需要时使用。在该时间点，可以直接使用它们，而不会由于制备有任何延迟。用于阻止出血的常规制剂包含相当高浓度的凝血酶，为200-1000活性单位/ml。在整形外科使用时，可以看到会有瘢痕形成增加的危险。目前在临床上通过稀释浓凝血酶溶液来制备低浓度的凝血酶溶液。还没有即开即用的制剂。因此，在一个进一步的方面，本发明提供一种稳定的凝血酶组合物，其具有显著较低浓度的凝血酶，为5-20活性单位/ml，和其在整形外科中的应用。本发明的另一个方面是利用纤溶酶，尿激酶或tPA作为血栓溶解剂的已知性质。因此，本发明提供上述组合物在制备用于血栓溶解治疗的药物中的应用，其中丝氨酸蛋白酶选自纤溶酶，尿激酶和组织纤维蛋白溶酶原激活剂。一个相关的方面提供一种在需要的患者中进行血栓溶解治疗的方法，包括以足以进行所述治疗的量给患者施用上述的组合物，其中该组合物中丝氨酸蛋白酶选自纤溶酶，尿激酶和组织纤维蛋白溶酶原激活剂。在这两个相关的方面，所述的血栓溶解治疗的非限制性的例子是，为了治疗心肌梗塞或为了治疗中风。如在本发明的组合物方面所述，由可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂和稳定剂M导致的稳定增强不应当被视为M所提供的附加的抑制作用。实际上，如在说明性的实施例A中所述，M缺乏对任何丝氨酸蛋白酶的抑制能力。不希望受到理论的束缚，本发明人相信，所观测到的令人惊奇的稳定作用增强是通过本发明的组合物中可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂和稳定剂M之间有利的协同作用而实现的。因此，在另一个方面，本发明提供a)可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂和b)式I的稳定剂M:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>其中n是0、1或2;X是0、N或CH2;W-R4相同或不同-CH广NH-R6、-CO-O-R6，-CH广NH-CO-腿6、-CH广O-CO-NHR6;R5是R1-R"或P-Q;P选自-(CH丄-和-(CH2)m-Y-(CH丄-、其中m是l-6且Y是0、NH或S;选自H、-CH广R6、—CH2-0—R6、-CH广S-R6、-C0-NH-R6、-CH2-NH-CO-R6、-CH广O-CO-R6、-CH2-NH-C0-0R6、-CH厂NH-CS-NHR6和Q选自H、-S03、-C00H、-NH2、-OH和-C0冊2;R6各自独立地选自H、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的苯甲基、取代或未取代的芳基或单-、二-、或三环的具有一个或多个杂原子的未取代或取代的杂芳环和非芳香杂环、所述取代的基团的取代基选自低级烷基、囟素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂-芳香化合物、非芳香杂环、烷氧基、烷氨基；的组合在稳定丝氨酸蛋白酶组合物中的应用，其中可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂和稳定剂M发挥协同作用以产生稳定丝氨酸蛋白酶的作用。在本发明的可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂和稳定剂组合在稳定丝氨酸蛋白酶组合物中的应用中，可以使用的具体组分和化合物M的取代基的选择如上述在本发明的组合物方面所讨论。在另一个方面，本发明提供一种稳定丝氨酸蛋白酶的方法，包括将丝氨酸蛋白酶与a)所述丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂；和b)式I的稳定剂M:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(I)其中n是0、1或2;X是O、N或CH2;W-R4相同或不同、选自H、-CH广R6、-CH广O-R6、-CH广S-R6、-CH广NH-R6、-CO-O-R6、-CO-NH-R6、-CH广NH-CO-R6、-CH广O-CO-R6、-CH广NH-CO-NHR6、-CH2-NH-CO-OR6、-CH广NH-CS-NHR6和-CH广0-C0-匿6;R5是R1-W或P-Q;P选自-(CH丄-和-(CH2)m-Y-(CH2)m-、其中m是l-6且Y是0、NH或S;Q选自H、-S03、-C00H、-NH2、-OH和-C0冊2;R6各自独立地选自H、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的苯甲基、取代或未取代的芳基或单-、二-、或三环的具有一个或多个杂原子的未取代或取代的杂芳环和非芳香杂环、所述取代的基团的取代基选自低级烷基、卣素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂-芳香化合物、非芳香杂环、烷氧基、烷氨基；或其药学可接受的盐混合。在本发明的这种稳定丝氨酸蛋白酶组合物的方法中，可以使用的具体组分和化合物M的取代基的选择如上述在本发明的组合物方面所讨论。本发明一个进一步的方面涉及的是上述的组合物在吸附到固状物体中的应用，以使该固状物体可以提供所述的酶活性。具体地，在很多外科应用中令人感兴趣的是，进入和特别地从动脉中出来，同时对于出血只有尽可能小的伤害。为了阻止动脉出血，先前建议使用"动脉塞"(该物体也称作动脉封口装置、股接入封闭装置(当使用股动脉来进入，例如在血管造影术中)，血管止血装置和穿刺封闭装置)的形式，例如由胶原或其他生物可降解的材料制备而成。根据本发明的这个方面，有利地可以用根据本发明的组合物涂敷该塞，其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶。该塞可以更迅速地封闭动脉的开口，其中该组合物中的凝血酶是为了使塞周围的血液凝固。因此，在这个方面，本发明提供了一定量的根据本发明的组合物吸附于其上的血管止血装置，其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶。该血管止血装置优选是用生物可降解的固体或半固体材料例如例如胶原、壳聚糖或其他生物学聚合物制成的。本发明的另一个方面涉及新鉴别出N，N-二乙基乙二胺作为丝氨酸蛋白酶抑制剂。因此，在这个方面，本发明提供N，N-二乙基乙二胺作为丝氨酸蛋白酶的抑制剂的应用，以及一种抑制丝氨酸蛋白酶的方法，包括将其用抑制量的N，N-二乙基乙二胺混合。在本发明的该方面的一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶是纤溶酶。在本发明的该方面的另一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶是凝血酶。为了达到本发明不同方面的所有优点，一般优选根据本发明的组合物是选自溶液和凝胶的形式。在这个方面，更优选水性溶液和水性凝胶。定义本文使用的术语"低级烷基"是指无支链或支链的，环状，饱和或不饱和(烯基或炔基)的烃基，其可以是取代的或未取代的。当为环状时，烷基优选是C3-C12，更优选C5-C10,最优选C5-C7。当为非环状时，烷基优选是Cl-CIO，更优选C1-C6，更优选曱基，乙基，丙基(正丙基，异丙基)，丁基(支链或无支链)或戊基，最优选甲基。本文使用的术语"芳基"是指芳香基团，例如苯基或萘基，或包含一个或多个、优选选自N，0和S杂原子的单-、二-或三环杂芳基，例如吡咬基，吡咯基，奮啉基，呋喃基，噻吩基，噁二唑基，噻二唑基，噻唑基，噁唑基，吡唑基，三唑基，四唑基，异噁唑基，异噻唑基，咪唑基，嘧啶基，吲哚基，吡嗪基，吲唑基，嘧啶基，噻吩基，吡喃基，咔唑基，吖啶基，喹啉基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，嘌呤基，噌啉基，蝶啶基。本文使用的术语"官能团"在未保护的情况下是指羟基-，硫醇基-，氛基官能团，羧酸，以及在保护的情况下是低级烷氧基，N-，0-，S-乙酰基，羧酸酯。本文使用的术语"杂芳基"是指包含一个或多个优选自N，O和S的杂原子的芳基，例如吡啶基，吡咯基，喹啉基，呋喃基，噻吩基，噁二唑基，噻二唑基，噻唑基，噁唑基，吡唑基，三唑基，咪唑基，嘧啶基，吲咮基，吡嚷基或吲唑基。本文使用的术语"非芳香杂环"是指包含一个或多个、优选选自N,0和S的杂原子的非芳香环状基团，例如环氨基，例如吡咯烷基，哌啶基，哌溱基，吗啉基或环醚例如四氢呋喃基，单糖。本文使用的术语"卤素"是指氟，氯，溴或碘。本文使用的术语"取代的"是指所涉及的基团被官能团例如羟基,氨基，硫(sulfide)，曱硅烷基，芳基等取代。用于本发明的组合物的药学可接受的加成盐的例子包括由无机酸例如盐酸，氢溴酸，磷酸，偏辨酸，硝酸和疏酸及由有机酸例如酒石酸，醋酸，柠檬酸，苹果酸，乳酸，富马酸，苯甲酸，羟乙酸，葡糖酸，琥珀酸和芳基磺酸衍生的那些。本文所述的药学可接受的赋形剂例如媒介物、辅助剂、载体或稀释剂是本领域技术人员公知的，并且易于公开购买到。药学可接受的载体可以是对活性化合物为化学惰性并且在使用条件下没有有害的副作用或毒性的那些。可以从例如Remington:TheScience和PracticeofPharmacy,19thedition,MackPrintingCompany,Easton，Pennsylvania(1995)找到药物制作为本发明的详述，在根据本发明的組合物和方法中使用的抑制剂的可能选择是"N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶及其衍生物"。这是指具有式IV的化合物其中R'选自H、Cl-C6-烷基、C3-C7-环烷基、苯基、苯曱基乙酰基和苯曱酰基；X选自氧、氮和硫；f和f分别独立地选自H、卣素、羟基、C1-C6-烷基、C3-C7-环烷基、CI-C6-烷基氧；和f选自H、C1-C6-烷基、芳基烷基和酰基。优选该抑制剂具有式V:其中W选自Cl-C6-烷基、C3-C7-环烷基、苯基和苯曱基；112和113分别独立地选自H、卣素、羟基、Cl-C6-烷基、C3-C7-环烷基和Cl-C6-烷基氧。实施例下面的实施例是用于解释本发明，而不应解释为限制。在下面对根据本发明进行的实验的描述中，使用达到初始活性70%所花费的时间作为酶溶液的稳定的数值。选择该值标记为"T70%"，原因是它对应于在商业产品的寿命中可以接受的活性最大可允许的丧失。在实验研究中，使用高温(37C)，及高浓度的酶。这是为了在合理的较短时间内得到稳定性数据，而无需等待几月或几年。已经研究了稳定性对温度的依赖度，结果在实施例l中给出。该研究表明，与在实际测定的过程(37x:)相比，在室温下灭活过程减慢了约3倍，在冷藏温度下减慢了约20倍。此外，灭活过程是浓度依赖性的，在较高浓度的酶的情况下灭活更为迅速。在实施例1中使用的凝血酶的浓度是lmg/ml(或3300单位/ml)，即高于在当前商业可购的制品和/或装置中使用的0.1-0.3mg/ml浓度。浓度依赖性的研究表明，在这些浓度下灭活过程比实施例1中使用的浓度下慢3-4倍。将此综合给出10-12之间的因子，将其乘以T70%值，以得到与包含丝氨酸蛋白酶的商业产品例如包含凝血酶的止血制剂的室温贮存条件相对应的值。在表1中，具有N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶和MOPS的组合物的T70%为120天。这与0.1-0.3mg/ml产品在室温条件下超过1200天，即超过3年的值相对应。在溶液中凝血酶的稳定性方面，这明显超过了先前得到的任何材料。-乂凝j&雜^潜;t为了确定凝血酶溶液的促凝活性，测定在加入特定的人凝血酶(来自血浆，3300单位/mg，BiovitrumAB,Sweden)溶液的不同稀释液后纤维蛋白原溶液(1.3mg/ml)的凝固时间。用AmelungenKc1血凝计(Amelungen，Germany)测定凝固时间。为了研究含不同添加物的凝血酶溶液的稳定，将样品在保持温度为37C的恒温室中温育。以不同时间间隔取出等份液，测定在这些等份液中保留的凝血酶活性。可以由所获得的值构建活性衰减曲线。在10mMHEPES，0.13MNaCl緩冲液，pH7.4中，1mg/ml的凝血酶溶液的活性衰减曲线表明，在37t:T70%值为大约1.6天。在室温(大约21'C)下的相应实验表明T70%值为5.4天，而在冷藏贮存(约5'C左右)后，T70。/。值为36天。这样，如所期望的那样，具有强烈的温度依赖性。将具有指定的稳定添加物的在10mMHEPES和pH7.4的0.13MNaCl緩沖液中包含1mg/ml的凝血酶的溶液置于恒温室中，确定它们的活性衰减曲线。所得到的结果如表l所示。包括不包含添加物的相应的1mg/ml凝血酶溶液的数据以用于比较。表1凝血酶的稳定<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>显然，受试化合物都具有稳定作用，但是，如用这些组合所得到的良好结果所证明的那样，根据本发明的抑制剂和包含吗啉的化合物的组合具有协同作用。如上表所示，单独加入0.20MM0PS稳定增强，因子为4.7,加入0.5mM的可逆凝血酶抑制剂氨基苯曱脒，稳定增强，因子为12.5。但是，本发明的组合好得多地稳定了该凝血酶组合物，因子为42.5。本发明的MOPS和N，N-二乙基乙二胺的组合在稳定酶方面也比单独的组分更好。类似地，0.20MMOPS和1.9mMN-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶的组合能够非常高地增强稳定，因子为75，而单独组分增强稳定的因子分别为4.7和22。在该研究中使用的凝血酶是来自血浆的人凝血酶。也已经研究了重组人凝血酶，其基本上显示了相同的特性。,滋辦2-乎凝J&雜的潜定研究了牛凝血酶的稳定。实验程序与实施例l相同，但是所使用的牛凝血酶(Baxter)的浓度是0.4mg/ml。在37。C下贮存时，HEPES緩沖液中的凝血酶溶液显示的T70%值是1.3天。在HEPES緩沖液加3.0mMN-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶和0.20MMOPS中的凝血酶溶液显示的T70%值是54天。所得到的结果表明，牛凝血酶比所研究的人凝血酶制品多少更不稳定，但是通过本发明的组合得到了非常良好的稳定作用。研究了包含低浓度的凝血酶的组合物中凝血酶的稳定作用。根据HEPES緩冲液，pH7.4中15.0活性单位/ml的人凝血酶(来自血浆，3300单位/mg，BiovitrumAB,Sweden)的溶液显示的T70%值是23天。HEPES緩冲液，pH7.4加2.GmMN-(2，-苯氧基)-4-氨基吡，定和0.20MMOPS中的对应溶液显示的T70%值是92天。《施辦4测定根据本发明的纤溶酶的溶液的稳定作用。用发色肽底物ChromozymTH(Pentapharm，Switzerland),在分光光度计中在405nm处测定吸收的改变确定纤溶酶的活性。将包含在10mMHEPES和0.13MNaCl，pH7.4中的100pg/ml的纤溶酶(比活性3.2单位/mg，Sigma-Aldrich)以及如下表2所示的稳定剂的溶液在37。C下温育，以不同的时间间隔取样以用于活性确定。所得到的结果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>这些结果证明了，用根据本发明的组合获得了非常强的稳定作用。0.20M吗啉增强纤溶酶组合物稳定性的因子为4，0.13MN，N-二乙基乙二胺的因子为2.7，1.3mM氨基苯甲脒的因子为17。但是，吗啉和N，N-二乙基乙二胺的组合增强纤溶酶组合物稳定性的因子为7.3,吗啉和氨基苯曱脒的组合增强稳定的因子为72。《滋辦J-腐蛋^癉^裙定测定根据本发明的胰蛋白酶的溶液的稳定。用甲苯磺酰精氨酸甲酯(TAME)作为底物并在分光光度计中在247nm处测定吸收的改变确定纤溶酶的活性。将包含在10mMHEPES和0.13MNaCl,pH7.4中的100ng/ml的胰蛋白酶(TPCK-treated，Sigma-Aldrich)以及如下表3所示的稳定剂的溶液在37。C下温育，以不同的时间间隔取样以用于活性确定。所得到的结果如表3所示。表3胰蛋白酶的稳定<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>同样，根据本发明的组合物的稳定作用是最大的。因此，单用0.5M吗啉增强纤溶酶组合物稳定性的因子为13，单用1mM苯甲脒增强稳定的因子为72。另一方面，本发明的组合增强稳定性的因子为147。-舍0^凝羞雜^籍定1^^包含1.0至2.0%羧曱基纤维素(CMC)的凝血酶溶液与人皮肤的粘附性的试验表明，加入CMC极大地增强了粘度和粘附性。但是令人惊奇地，我们也发现，这些凝血酶溶液的稳定性进一步地增强，将包含2.0%CMC的0.5mM氨基苯曱脒，0.20MMOPS，10mMHEPES，0.13MNaCl的1mg/ml人凝血酶(来自血浆，3300单位/mg,BiovitrumAB,Sweden)溶液在37。C下温育，确定活性衰减曲线。所得到的T70%值是175天。《滋浙7-^岸趟#餘#秉合參#潜定#^也研究了4种其他聚合物乙基羟乙基纤维素(EHEC)、马铃薯淀粉、玉米淀粉和冷水鱼明胶。这四种聚合物都增强了凝血酶溶液的粘附性和粘度。进一步研究了这些聚合物与凝血酶溶液的相容性和稳定性，包括将包含各种聚合物的0.20MM0PS、0.5mM氨基苯曱脒、10mMHEPES、0.13MNaCl，pH7.4中1mg/ml人凝血酶(来自血浆，3300单位/mg,BiovitrumAB，Sweden)溶液在37。C下温育。所使用的聚合物的浓度是EHEC，0.6%;两种不同的淀粉，4.0%;和明胶，12.8%。EHEC与凝血酶完全相容，并获得了与不含EHEC的相应溶液相同的T70%值，即65天左右。包含淀粉的溶液的T70%值是22和26天。在明胶中凝血酶的稳定是非常良好的，T70%值是90天以上，这表明，冷水鱼明胶具有额外的稳定作用。用兔子在一系列试验中试验本发明的组合物阻止出血的能力。所选择的模型为在肝上切口，这是一个经常使用的模型。打开兔子的腹部，暴露出肝。在肝表面制造出3mm长的标准切口，并用注射器将0.10ml的受试溶液施用于该伤口。测定止血的时间。用每种溶液进行10-12次实验。在去掉每个系列试验中的最高和最低值后计算出血时间的平均值。为进行比较，在该研究中也包括常用的止血剂Tisseel(Baxter),它是一种纤维蛋白胶。基本上根据制造商的推荐使用Tisseel。用具有混合室的双注射器将0.2ml的溶液施用于每个伤口。所得到的结果在下表4中给出。表4出血实验<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>从这些结果显而易见地看出，根据本发明的稳定的凝血酶溶液在出血患者的快速完成止血中是最有效的，它与常用的药剂相当或者更好。-与/s封并w亩容^将包含0.4mg/ml人凝血酶(来自血浆，3300单位/mg,BiovitrumAB，Sweden)的10mMHEPES,0.14MNaCl，0.5mM氨基苯曱脒，0.20MMOPS,pH7.4的溶液吸附到一片聚氨酯貪(由以HartmannScandicareAB,Anderstorp，SwedenLigasone出售)上。使用的溶液的量足以饱和该聚氨酯片。将该片转移到试管中，然后封闭以防止蒸发。将该试管保存在37。C下，通过在聚氨酯片上轻压以不同时间间隔取溶液的样品。活性衰减曲线显示的T70%值是74天，对应地稳定性增强的因子是46。测定稳定的溶液中凝血酶对表面的吸附。将约3x3mm的壳聚糖(至少85%脱乙酰化，Sigma-Aldrich)的固体小片在400单位/ml人凝血酶(来自血浆，3300单位/mg，BiovitrumAB，Sweden)的10mMHEPES,0.13MNaCl，pH7.4溶液中温育10分钟。该溶液具有下列添加物l)无，2)0.10M吗啉，2mMN-(2'-苯氧基)-4-氨基吡啶,3)0.10M吗啉，2mMN-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶，0.5%羧曱基纤维素。然后取出该小片，并在滤纸上干燥。为了得到凝血酶凝固活性的测定值，将一个小片置于试管中，并加入0.4ml的1.3mg/ml纤维蛋白原溶液。为了改善对凝固的检测，该试管也包括一个小的钢球。小片在不同温育混合物中初始获得的凝固时间在1到4分钟之间变化。在Eppendorf管中在37。C下温育7天后，在溶液l)中温育的小片的凝固时间极大地延长。该值在24到27分钟之间。相反，在溶液2)和3)中温育的小片的凝固时间在1到2.5分钟的范围内，即与初始值相同。显然，用溶液2)和3)获得了对凝血酶活性的强烈稳定作用。为了测定体内止血活性，在根据实施例8所述的动物模型中，将在溶液3)中温育的壳聚糖小片应用于兔子的肝的伤口上。止血的平均时间是27秒(基于6次试验)。说效^其滋辨^-哮琳不^凝J&^^賴浙评价了吗啉是凝血酶抑制剂的可能性。通常通过凝固试验测定凝血酶的纤维蛋白原凝固活性，其中通过机械或光学装置检测纤维蛋白原溶液凝固的时间。在该实验程序中的凝固试验是在pH7.4的0.01MHEPES、0.13MNaCl緩沖液中进行的，该实验是根据标准方法(EU药典)进行的。使用包含89单位/ml的人凝血酶(来自血浆，3300单位/mg,BiovitrumAB，Sweden)溶液，测定1/5、1/10和1/16的稀释液。通过加入调节到pH7.4的浓吗啉溶液在HEPES緩冲液中来制备不同浓度的吗啉溶液。当将吗啉溶解于水中时，pH升高至9-10，这样加入HC1以得到pH7.4。这样也增强了溶液的离子强度。表I显示了所得到的结果。用标准曲线将观测到的凝固时间转换为凝血酶的浓度。表5吗啉的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>从这些结果显而易见地，将吗啉的浓度提高到一定水平会延长凝固时间。但是，当用NaCl增强离子强度时，观测到了相同的现象，显示了相同的特性。这样，在所有的可能性中，离子强度增强导致了作用的延长。进一步地，已知离子强度从O.15M提高到O.22M导致纤维蛋白的聚合文变(B.Bloraback，r/ro迈6os2.siesearc力，vol.83，(1996),p.1-75，特别是p.18)。这实际上对应于在本实验系列中研究的范围，其中NaCl的初始浓度是O.13M,然后提高到0.18M，并一直提高到O.33M。这也对应于所观测到的平台水平。总之，吗啉本身不是一种凝血酶的抑制剂。权利要求1.稳定的丝氨酸蛋白酶组合物，包含a)丝氨酸蛋白酶；b)所述丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂；和c)具有式I的稳定剂Mid="icf0001"file="S2005800516550C00011.gif"wi="58"he="27"top="60"left="39"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中n是0、1或2；X是O、N或CH2；R1-R4相同或不同、选自H、-CH2-R6、-CH2-O-R6、-CH2-S-R6、-CH2-NH-R6、-CO-O-R6、-CO-NH-R6、-CH2-NH-CO-R6、-CH2-O-CO-R6、-CH2-NH-CO-NHR6、-CH2-NH-CO-OR6、-CH2-NH-CS-NHR6和-CH2-O-CO-NHR6；R5是R1-R4或P-Q；P选自-(CH2)m-和-(CH2)m-Y-(CH2)m-、其中m是1-6且Y是O、NH或S；Q选自H、-SO3、-COOH、-NH2、-OH和-CONH2；R6各自独立地选自H、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的苯甲基、取代或未取代的芳基或单-、二-、或三环的具有一个或多个杂原子的未取代或取代的杂芳环和非芳香杂环，所述取代的基团的取代基选自低级烷基、卤素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂-芳香化合物、非芳香杂环、烷氧基、烷氨基；或其药学可接受的盐。2.根据权利要求l的组合物，其中所述丝氨酸蛋白酶选自胰蛋白酶、激肽释放酶、凝血酶、纤溶酶、尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、IX因子的活化形式、X因子的活化形式和XI因子的活化形式.3.根据前述任一权利要求的组合物，其中所述可逆抑制剂显示的Ki值是0.01到2mM,例如0.04mM到0.5mM。4.根据前述任一权利要求的组合物，其中所述丝氨酸蛋白酶是凝血酶。5.根据权利要求4的组合物，其中该可逆抑制剂选自N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶及其衍生物、苯甲脒、N，N-二乙基乙二胺、氨基苯曱脒、脒基吡啶和叔丁基脒.6.根据权利要求4的组合物，其中该可逆抑制剂选自N-(2，_苯氧基)-4-氨基吡啶及其衍生物、N，N-二乙基乙二胺、脒基吡啶和叔丁基脒.7.根据权利要求4的组合物，其中该可逆抑制剂是N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶或其衍生物。8.根据权利要求l-3任一项的组合物，其中该丝氨酸蛋白酶是纤溶酶。9.根据权利要求8的组合物，其中该可逆抑制剂选自N，N-二乙基乙二胺、氨基苯甲脒和苯甲脒。10.根据权利要求1-3任一的组合物，其中该丝氨酸蛋白酶是胰11.根据权利要求10的组合物，其中该可逆抑制剂选自氨基苯甲脒和苯甲脒。12.根据前述任一权利要求的组合物，其中式I中n是l或2。13.根据前述任一权利要求的组合物，其中式I中n是l。14.根据前述任一权利要求的组合物，其中稳定剂M是式II的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(II)其中RLR4相同或不同，选自H、-CH2-R6;R5是Ri-R"或P-Q;P选自-(CH丄-和-(CH2)迈-Y-(CH丄-，其中m是l-6且Y是0、NH或S;Q选自H、-S03、-C00H、-NH2、-OH和-CONH2;R6各自独立地选自H、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的苯曱基、取代或未取代的芳基或单-、二-、或三环的具有一个或多个杂原子的未取代或取代的杂芳环和非芳香杂环，所述取代的基团的取代基选自低级烷基、卣素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂-芳香化合物、非芳香杂环、烷氧基、烷氨基；或其药学可接受的盐。15.根据权利要求14的组合物，其中稳定剂M是式III的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(III)其中R5是-CH广R6或P-Q;P选自-(CH丄-或-(CH2)m-Y-(CH2)m-，其中m是l-6且Y是0、NH或S;Q选自H、-S03、-COOH、-NH2、-OH和-C0冊2;R6各自独立地选自取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的苯曱基、取代或未取代的芳基、所述取代的基团的取代基选自低级烷基、卣素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂-芳香化合物、非芳香杂环、烷氧基、烷氨基；或其药学可接受的盐。16.根据权利要求15的组合物，其中稳定剂M选自吗啉、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、吗啉代丁基磺酸、吗啉代丙基羧酸、吗啉代乙基醇和吗啉代乙基磺酸。17.根据权利要求16的组合物，其中稳定剂M选自吗啉和3-(N-吗啉代)丙磺酸.18.根据权利要求17的组合物，其中稳定剂M是吗啉。19.根据前述任一权利要求的组合物，其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制剂是N-(2'-苯氧基)-4-氨基吡啶，稳定剂M是吗啉。20.根据前述任一权利要求的组合物，其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制剂是N-(2'-苯氧基)-4-氨基吡啶，稳定剂M是3-(N-吗啉代)丙磺酸。21.根据前述任一权利要求的组合物，进一步包含粘性和粘附性聚合物，选自多糖和明胶。22.根据权利要求21的组合物，其中所述粘性和粘附性聚合物是多糖。23.根据权利要求22的组合物，其中所述多糖选自淀粉、其衍生物、纤维素、其衍生物及其混合物。24.根据权利要求23的组合物，其中所述多糖选自羧甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素及其混合物。25.根据权利要求22的组合物，其中所述多糖是羧甲基壳聚糖。26.根据权利要求22-25任一的组合物，其中所述多糖的浓度是0.l-5%。27.根据权利要求21的组合物，其中所述粘性和粘附性聚合物是明胶。28.根据权利要求27的组合物，其中所述明胶是冷水鱼明胶。29.根据权利要求27-28任一的组合物，其中所述明胶的浓度是0.5-20%。30.根据前述任一权利要求的组合物，其中所述丝氨酸蛋白酶的浓度是0.001-2mg/ml。31.根据前述任一权利要求的组合物，其中所述丝氨酸蛋白酶是凝血酶，凝血酶的浓度是5-35QQ活性单位/ml。32.根据前述任一权利要求的组合物，其中所述丝氨酸蛋白酶是凝血酶，凝血酶的浓度是2Q0-10QG活性单位/ml。33.根据前述任一权利要求的组合物，其中所述丝氨酸蛋白酶是凝血酶，凝血酶的浓度是5-20活性单位/ml。34.根据前述任一权利要求的组合物，其中所述丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂的浓度是G.1-10mM。35.根据前述任一权利要求的组合物，其中所述稳定剂的浓度是0.02-0.5M。36.根据前述任一权利要求的组合物，其为选自溶液和凝胶，例如水性溶液或水性凝胶的形式。37.根据前述任一权利要求的组合物作为药物的应用。38.根据权利要求1-36任一项的组合物在制备实现给出血患者止血的药物中的应用，其中丝氨酸蛋白酶是凝血酶。39.实现给出血患者止血的方法，包括以足以减少或阻止所述出血的量在出血位点上使用根据权利要求l-36任一项的组合物，其中该组合物中所述丝氨酸蛋白酶是凝血酶。40.根据权利要求33的组合物在整形外科中的应用。41.根据权利要求l-36任一项的组合物在制备用于血栓溶解治疗的药物中的应用，其中所述丝氨酸蛋白酶选自纤溶酶、尿激酶和组织纤维蛋白溶酶原激活剂。42.在需要的患者中进行血栓溶解治疗的方法，包括以足以进行所述治疗的量给患者施用根据权利要求l-36任一项的组合物，其中该组合物中所述丝氨酸蛋白酶选自纤溶酶、尿激酶和组织纤维蛋白溶酶原激活剂。43.可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂和权利要求1中所定义的稳定剂M的组合在稳定丝氨酸蛋白酶组合物中的应用，其中所述可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂和所述稳定剂M协同作用以产生丝氨酸蛋白酶稳定效果。44.根据权利要求43的应用，其中该丝氨酸蛋白酶是如权利要求2、4、8、10、30、31、32和33任一项中所定义。45.根据权利要求43-44的应用，其中该可逆抑制剂是如权利要求3、5、6、7、9、11和34任一项中所定义。46.根据权利要求43-45任一的应用，其中稳定剂M是如权利要求12-18和35任一项中所定义。47.根据权利要求43-46任一项的应用，其中所述组合进一步包含选自多糖和明胶的粘性和粘附性聚合物。48.根据权利要求47的应用，其中该粘性和粘附性聚合物是如权利要求22-29任一项中所定义。49.根据权利要求43-48任一项的应用，其中所述可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂是N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶和所述稳定剂M是3-(N-吗啉代)丙磺酸。50.稳定丝氨酸蛋白酶组合物方法，包括将丝氨酸蛋白酶与a)所迷丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂；和b)式I的稳定剂M或其药学可接受的盐混合<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(I)其中n是0、1或2;X是0、N或CH2;RiR4相同或不同、选自H、-CH广R6、-CH广O-R6、-CH厂S-R6、-CH2-NH-R6、-C0-0-R6、-CO-匪-R6、-CH广NH-C0-R6、-CH厂O-C0-R6、-CH广NH-C0-NHR6、-CH2-NH-C0-0R6、-CH2-冊-CS-NHR6和-CH2-0-CO-NHR6;R5是RLR4或P-Q;P选自-(CH丄-和-(CH丄-Y-(CH丄-，其中m是l-6且Y是0、NH或S;Q选自H、-S03、-COOH、-NH2、-OH和-C0NH2;R6各自独立地选自H、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的苯曱基、取代或未取代的芳基或单-、二或三环的具有一个或多个杂原子的未取代或取代的杂芳环和非芳香杂环；所述取代的基团的取代基选自低级烷基、卣素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂-芳香化合物、非芳香杂环、烷氧基、烷氨基。51.根据权利要求50的方法，其中该丝氨酸蛋白酶是如权利要求2、4、8、10、30、31、32和33任一项所定义。52.根据权利要求50-51的方法，其中该可逆抑制剂是如权利要求3、5、6、7、9、11和34任一项所定义。53.根据权利要求50-52任一项的方法，其中稳定剂M是如权利要求12-18和35任一项所定义。54.根据权利要求50-53任一项的方法，进一步包括将丝氨酸蛋白酶与选自多糖和明胶的粘性和粘附性聚合物混合。55.根据权利要求54的方法，其中该粘性和粘附性聚合物是如权利要求22-29任一项所定义。56.根据权利要求50-55任一项的方法，其中所述可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂是N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶和所述稳定剂M是3-(N-吗啉代)丙磺酸。57.根据权利要求1-36任一项的组合物吸附于其上的血管止血装置，其中组合物中所述丝氨酸蛋白酶是凝血酶。58.根据权利要求57的血管止血装置，包括生物可降解的材料，例如选自壳聚糖和胶原。59.N，N-二乙基乙二胺作为丝氨酸蛋白酶抑制剂的应用。60.根据权利要求59的应用，其中该丝氨酸蛋白酶选自凝血酶和纤溶酶。61.抑制丝氨酸蛋白酶的方法，包括向其中混入抑制量的N，N-二乙基乙二胺。62.根据权利要求61的方法，其中该丝氨酸蛋白酶选自凝血酶和纤溶酶。全文摘要提供一种组合物，其包含丝氨酸蛋白酶；所述丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂；和具有式I的稳定剂M也提供该组合物作为药物的应用，和其他应用，以及使用其各种性质的方法。文档编号A61K31/5377GK101272790SQ200580051655公开日2008年9月24日申请日期2005年9月22日优先权日2005年9月22日发明者H·阿格兰,L-O·安德松申请人:特罗比奥股份公司