专利名称：一种快速检测大豆脂氧酶缺失的方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质的检测方法，特别是涉及一种通过改进的SDS-PAGE法检测大豆脂氧酶(lipoxygenase)缺失的方法。
背景技术：
大豆是世界各国人民日常生活中最重要的植物油和优质蛋白质的摄取源之一，也是众多食品(如植物奶油、香肠)、工业制品(如润滑油、油墨)的主要原料或添加剂。但是由于大豆种子中脂肪氧化酶(lipoxygenase，缩写Lox，简称脂氧酶，它有三个同工酶， Lox-1,Lox-2,Lox-3)的存在。它催化种子中的亚油酸等具有顺，顺_1，4_戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸，生成过氧化氢的衍生物，最终被分解成易挥发的醛、醇、酮等小分子物质， 这些小分子物质是导致大豆种子破碎遇氧产生腥臭味的根源。由于大豆腥臭味的存在，影响了大豆制品的开发利用价值，以大豆为原料的加工企业为了去除大豆种子中的腥臭味， 不得不通过加热去腥和包埋等办法来去除它，但即便如此也未能完全去除腥臭味，增加了加热去腥成本，而且由于加热，还容易造成大豆蛋白质成分的变性，降低了大豆的营养价值。研究表明，大豆种质资源库中，存在Lox-1，-2，-3中单一缺失或双缺失的大豆资源，通过人工杂交技术，可以从根本上去除大豆腥臭味。问题是如何从众多的杂交后代中筛选鉴别出Lox中的3个同工酶的某一个或两个缺失的后代。目前常用的方法主要有3种聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法(SDS-PAGE)，等电点电泳法(IEF-PAGE)和β-胡萝卜素褪色法。其中，与本发明最相近的技术是SDS-PAGE法。在判断Lox是完全缺失与否的情况下，三者都可以准确判定，其中SDS-PAGE法是最简便易行的方法，而当要判定Lox-1，-2，-3中某个缺失与否时，IEF-PAGE法最准确，但检测步骤也最复杂不易掌握，费时间，检测成本也最高。胡萝卜素褪色法虽与SDS-PAGE法相比较更为准确但也存在着检测成本高等弊端，现有SDS-PAGE法虽然检测方法简便易行，但在粗蛋白提取方面采用的方法是常规提取大豆全蛋白所通用的方法，即切取大豆种子种脐反侧的子叶的粉末5-10mg，放入1. 5ml离心管，加入蛋白提取缓冲液(Tris-HCl，pH7. 2)，振荡器震荡 10秒左右，静置15-30min，即可利用SDS-PAGE上样跑胶，所用的分离胶也是分析大分子量蛋白通用的7. 5%的浓度的胶，对分子量大且三个分子量都很接近的蛋白质种类来说不适合，在判断Lox中某一个或两个缺失与否时，几乎无法准确判断，存在着误判高的缺点。
发明内容
针对上述情况，本发明所要解决的技术问题是提供一种快速简便，能够用肉眼就能简单准确地区分鉴别Lox-I和Lox-2单一缺失或两个缺失与否的新方法。本发明提供的方法是对原有SDS-PAGE方法的改进，主要针对现有技术的粗蛋白提取方法和制胶技术进行了改进，改进后的方法，可用于Lox-I和Lox-2缺失的鉴定，且操作简单、快速，鉴定结果直观准确。具体的本发明所要解决的技术问题是通过以下方法实现的
本发明的组成本发明由大豆Lox脂氧酶蛋白的提取、聚丙烯酰胺凝胶的制备、 SDS-PAGE电泳，胶的染色及脱色五部分构成，其中Lox脂氧酶的提取、聚丙烯酰胺凝胶的制备是本发明的核心所在，SDS-PAGE电泳胶的染色和脱色为常规共有技术。本发明提供的一种快速检测大豆脂氧酶缺失的方法，其特征在于包括以下步骤(1)大豆Lox脂氧酶蛋白的提取切取种子细粉6 8mg，放入1. 5mL的离心管，加入提取缓冲液，用震荡器搅拌均勻，超声波萃取6 8min，室温下放置20 30min，再度搅拌后，5000r · mirT1离心5min,取上清液10 μ L-12 μ L用于SDS-PAGE电泳解析；(2)聚丙烯酰胺凝胶的制备成胶溶液的配制A液配制成由4. Og/L SDS, 3M Tris-HCl组成的混合溶液，pH值调至8. 8 ；B液配制成0. 48M HCl溶液，用Tris调整PH至7. O ；C液配制成由300g/L的丙烯酰胺，8g/L的双丙烯酰胺组成的混合溶液；P液配制成15g/L的过硫酸铵溶液；E液配制成0. 04g/L的核黄素溶液；分离胶的配制配制质量体积百分比为6. 75%的聚丙烯酰胺凝胶液，以规格为 16cmX 14cm的玻璃板制取Imm厚的胶2枚(需分离胶溶液36mL)为例，由以下体积的溶液配制而成A液9. 0mL，C液8. lmL，P液UmL，蒸馏水17. lmL，N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)0. 024 μ L ；浓缩胶配制以配制上述规格的胶为例，两块板需浓缩胶溶液12mL，由以下体积的溶液配制而成=B液3. 2mL, C液2. OmL, E液2. 6mL, P液0. 4mL,蒸馏水3. 8mL, N，N，N'， N'-四甲基乙二胺(TEMED)O. 012μ L ；(3) SDS-PAGE 电泳电泳缓冲液的配制配制成甘氨酸14. 4g/L，Tris 3. Og/L, SDS 1. 25g/L的混合溶液，备用；(4)胶的染色及脱色；其中，大豆Lox脂氧酶蛋白的提取过程为取种子1粒，在其胚轴的相反侧，切取种子细粉；其中所用提取缓冲液为0. 05mol · L^Tris-HCl, pH 7. 2，内含体积份数为2%的巯基乙醇，溴酚蓝指示剂适量，加入量为lmL。本发明对所述溴酚蓝指示剂的添加不做限制，应当理解的是，对于溴酚蓝指示剂适量添加应属本领域技术人员的常识范围内。本发明所提供的方法相较于现有技术具有以下优点1、在Lox脂氧酶蛋白提取方面，新改进的技术与传统技术的区别，在原来均质振荡后，全蛋白静置抽提之前，进行了 Smin左右的超声波处理，然后，在室温下静置抽提20 30min，再度搅拌，并于5000r IirT1离心5min，取上清液10μ L_12y L用于SDS-PAGE电泳解析。通过超声波处理，可以增加蛋白质的溶解度，从而不容易产生沉淀，而传统技术电泳时由于蛋白容易沉积在胶体中难以移动，导致Lox-1，Lox-2及Lox-3同工酶的分离和鉴别困难。2、在聚丙烯酰胺凝胶的制备方面将聚丙烯酰胺凝胶的浓度从原来的7. 5%降到6.75%，使凝胶的网格空隙加大，便于Lox同工酶在分离胶上移动。传统技术所使用的胶为
7.5%聚丙烯酰胺凝胶，同工酶Lox-I与Lox-2谱带几乎处于同一水平位置(图1)，图1参考自羽鹿牧太(夕· ^ <新品種「…6 的」Θ育成i O特性、九州沖绳農業研究七 > 夕一報告、2002、第40号、PP 79-86)，当利用此方法进行Lox同工酶缺失资源筛选及杂交后代缺失性状的鉴别时，容易引起同工酶缺失性状的误判。图2为本发明的6. 75%的新聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，通过此图可以辨明样品是否为缺失体，如图2所示，同工酶Lox-I与 Lox-2谱带的位置，较图1有明显的差异，在对同工酶缺失资源的筛选及杂交后代的同工酶缺失性状鉴别时，不易引起误判，具有较高的应用价值。
图1为常规SDS-PAGE电泳法检测脂氧酶缺失图谱；图2为本发明的大豆脂氧酶(lipoxygenase)缺失快速检测电泳图谱。
具体实施例方式以下通过实施例进一步阐明本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。实施例1实验材料母本早CS8000(Lox_3nul1) (cv.，China)，父本 FJ307(Lox-l，-2，-3triple-null) (cv. Japan)，11 个来自 CS8000 (早)XFJ307 (J) F2 群体
的样品。大豆Lox脂氧酶蛋白的提取分别各取种子1粒，在其胚轴的相反侧，用裁纸刀片切取种子细粉6mg，放入1. 5mL的离心管，加入ImL提取缓冲液(0. 05mol · L^Tris-HCl, pH 7. 2，内含2%的巯基乙醇，溴酚蓝指示剂适量)，用震荡器搅拌均勻，超声波萃取6min，室温下放置20min，再度搅拌后，5000r · mirT1离心5min，取上清液10 μ L用于SDS-PAGE电泳解析。聚丙烯酰胺凝胶的制备成胶溶液的配制A 液=SDS 2. Og, Tris 181. 2g，用 Imol · Γ1 HCl 将 pH 值调至 8. 8，最后加蒸馏水定容至500mL ；C 液Acrylamide 30g，力口 Bisacrylamide 0. 8g，力口蒸溜/K定容至 lOOmL。P液过硫酸铵1. 5g，加蒸馏水至IOOmL ；B液Imol · Γ1 HCl 240mL加蒸馏水200mL充分混勻后，用iTris调整PH至7. 0， 最后加蒸馏水定容至500mL ；E液核黄素％ig，加蒸馏水IOOmL混勻；电泳缓冲液的配制甘氨酸Glycine 14. 4g, Tris 3. Og, SDS 1.25g，加蒸馏水 IOOOmL混勻备用；染色液的配制考马丝亮蓝G-250 1. 5g，加440mL乙醇(分析醇)，60mL乙酸，蒸馏水调至IOOOmL混勻备用；脱色液的配制量筒量取200mL甲醇，50mL乙酸，加蒸馏水至IOOOmL混勻备用；
玻璃板的组装准备胶厚为Imm的普通SDS-PAGE用玻璃板(玻璃板规格为 16cmX14cm)，用70%乙醇将玻璃板的内表面擦拭干净凉干，放置防漏胶用密封硅胶条(或硅胶管)，1块板用4个大号长尾铗，左右两侧各2个，固定在玻璃板上(以不漏胶为准)，垂直放置于水平实验台上；分离胶的配制配制6. 75%的聚丙烯酰胺凝胶液按A液9. OmL, C液8. ImL, P液 1. 8mL,蒸馏水17. ImL的先后顺序加入到IOOmL的三角烧瓶中，充分混合均勻后，加入TEMED MyL，再度混勻后，平均倒入到两套玻璃板的缝隙中，胶面的上部轻轻滴入蒸馏水适量，防止胶面干燥，室温放置20 30min胶液凝固后，倒掉上部蒸馏水，将其倒立于桌面，除去残余水分备用；浓缩胶配制按下列顺序逐次加入B液3. 2mL, C液2. OmL, E液2. 6mL, P液0. 4mL, 蒸馏水3. SmL充分混勻后，再加入TEMED 12 μ L混勻，平均倒入到分离胶的上层，插入梳子， 室温放置20 30min。凝缩胶凝固后撤下固定铗，用蒸馏水轻轻冲洗掉凝固不完全的残胶， 用保鲜膜包好，4°C倒置冷藏备用。SDS-PAGE电泳将配好的电泳缓冲液适量，倒入垂直电泳槽内(以没过胶体底面为准)，安装玻璃板于垂直电泳槽上，注意胶的底面不要进入气泡；上槽倒入电泳缓冲液， 使液面没过玻璃板缺口。用微量注射器或多道微量移液器抽取试样10yL，慢慢注入进各泳道。电泳条件电压100V，电泳时间Ih左右，待溴酚蓝指示剂通过浓缩胶后，将电压升至 150V,电泳时间4h左右，溴酚蓝指示剂即将通过胶体底端的时候，停止电泳，取下胶体，放入染色液，轻摇染色lh，取出放入脱色液，轻摇脱色4h以上，在普通荧光玻璃灯箱上，确认 Lox同工酶的缺失状态，随后可将胶体干燥后，扫描保存。结果鉴定如图2所示，其中，左右两侧的泳道分别为母本早:CS8000(Lox-3null) (cv.，China),父本 FJ307(Lox_l，-2，-3triple-null)(cv. Japan),1-11 分别为 CS8000(早)父？307 ((^^2群体的部分样品的电泳图谱。通过此图可以辨明样品No. 1,5, 6，8 为 Lox-2，-3 缺失体，No. 2，4，7 为 Lox-I，-3 缺失体，No. 3，9，11 为 Lox_3 缺失体，No. 10 为Lox-I，-2，-3完全缺失体。如图2所示，同工酶Lox-I与Lox_2谱带的位置，较图1有明显的差异，在对同工酶缺失资源的筛选及杂交后代的同工酶缺失性状鉴别时，不易引起误判，具有较高的应用价值。实施例2大豆Lox脂氧酶蛋白的提取分别各取种子1粒，在其胚轴的相反侧，用裁纸刀片切取种子细粉8mg，放入1. 5mL的离心管，加入ImL提取缓冲液(0. 05mol · L^Tris-HCl, pH 7. 2，内含2%的巯基乙醇，溴酚蓝指示剂适量)，用震荡器搅拌均勻，超声波萃取Smin，室温下放置30min，再度搅拌后，5000r · mirT1离心5min，取上清液12 μ L用于SDS-PAGE电泳解析。聚丙烯酰胺凝胶的制备，SDS-PAGE电泳，染色及脱色过程按照实施例1的方法进行。以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的； 本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
权利要求
1. 一种快速检测大豆脂氧酶缺失的方法，其特征在于包括以下步骤(1)大豆Lox脂氧酶蛋白的提取切取种子细粉6 8mg，放入1.5mL的离心管中，加入提取缓冲液，用震荡器搅拌均勻，超声波萃取6 8min，室温下放置20 30min，再度搅拌后，5000r · mirT1离心5min,取上清液10 μ L-12 μ L用于SDS-PAGE电泳解析；(2)聚丙烯酰胺凝胶的制备成胶溶液的配制A液配制成由4. Og/L SDS, 3M Tris-HCl组成的混合溶液，pH值调至8. 8 ；B液配制成0. 48M HCl溶液，用Tris调整PH至7. 0 ；C液配制成由300g/L的丙烯酰胺，8g/L的双丙烯酰胺组成的混合溶液；P液配制成15g/L的过硫酸铵溶液；E液配制成0. 04g/L的核黄素溶液；分离胶的配制配制质量体积百分比为6. 75%的聚丙烯酰胺凝胶液，以规格为 16cmX 14cm的玻璃板制取Imm厚的胶2枚为例，需分离胶溶液36mL，由以下体积的溶液组成A 液 9. 0mL、C 液 8. lmL、P 液 1. 8mL、蒸馏水 17. lmL、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺 24yL;浓缩胶配制以配制上述规格的胶为例，两块板需浓缩胶溶液12mL，由以下体积的溶液组成=B 液 3. 2mL, C 液 2. OmL, E 液 2. 6mL，P 液 0. 4mL，蒸馏水 3. 8mL、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺12yL ；(3)SDS-PAGE 电泳电泳缓冲液的配制配制成甘氨酸14. 4g/L，Tris 3. Og/L, SDS 1. 25g/L的混合溶液，(4)胶的染色及脱色。
2.如权利要求1所述的一种快速检测大豆脂氧酶缺失的方法，其特征在于取种子1粒， 在其胚轴的相反侧，切取种子细粉。
3.如权利要求1所述的一种快速检测大豆脂氧酶缺失的方法，其特征在于所述提取缓冲液为0. 05mol · L-1Tris-HCl, pH 7. 2，内含体积分数为2%的巯基乙醇，溴酚蓝指示剂适量，加入量为lmL。
全文摘要
本发明是一种快速检测大豆脂氧酶缺失的方法，其是对现有SDS-PAGE技术的改进，本发明的方法由大豆Lox脂氧酶蛋白的提取、聚丙烯酰胺凝胶的制备、SDS-PAGE电泳，胶的染色及脱色五部分构成，其中Lox脂氧酶的提取、聚丙烯酰胺凝胶的制备是本发明的核心所在，SDS-PAGE电泳胶的染色和脱色为常规共有技术。本发明的方法克服了原有技术不能直观区分Lox-1，-2，-3中，单一缺失或双缺失的缺陷，提供了一种可用于Lox-1和Lox-2缺失的鉴定，且操作简单、快速，鉴定结果直观准确的方法。
文档编号G01N27/447GK102269731SQ20111015881
公开日2011年12月7日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者于佳, 冯晓, 刘伟, 刘燕, 姜妍, 李宏伟, 李远明, 杨冬, 王晓云, 王浩, 王绍东, 龚振平 申请人:黑龙江省大豆技术开发研究中心