一种土鳖虫酶解物的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物应用领域，具体涉及一种中药药材的应用。
【背景技术】
[0002] 血管内皮细胞位于血管内壁，是单层细胞，具有多种自分泌和旁分泌功能，能合成 分泌多种活性物质,如组织型纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制物、一氧化氮、前列环 素等，对维持正常血液循环有重要作用。因此，血管内皮细胞损伤会导致血管内皮失去正常 的功能而引发一系列疾病，如增加动脉粥样硬化形成的易感性，进一步增加血栓形成的机 会。
[0003] 土鳖虫是传统的活血化瘀药，含有多种氨基酸、微量元素、脂肪酸等，具有抗凝血、 抗氧化、调血脂的作用，传统中药以土鳖虫全虫入药，存在着服用剂量大，易造成微生物污 染等弊病。鉴于动物类蛋白质、粘多糖等大分子物质只有到达胃肠道后受消化酶、酸、碱等 作用，方可被酶解或者水解成小分子的肽、低聚糖和其他小分子物质，吸收入血而发生药 效，故生物酶仿生提取方法模拟体内消化过程，提取的有效成分治疗效果更佳。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种土鳖虫酶解物的应用，土鳖虫酶解物中有效成分含量 高，可以有效的保护血管内皮细胞。
[0005] 本发明所采用的技术方案是： 一种土鳖虫酶解物的应用，在制备保护血管内皮细胞药物中的应用。
[0006] 所述土鳖虫酶解物的制备方法由以下步骤制成： A、 净选土鳖虫，粉碎成细粉； B、 将土鳖虫细粉置于人工胃液中，密闭，于37 °C恒温水浴30min，加入胃蛋白酶水解 2-3小时，得到胃蛋白酶酶解液，将胃蛋白酶解液置于85°C恒温水浴15min，冷却至室温，离 心， C、 取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物； D、 取残渣加入人工肠液，密闭，于45°C恒温水浴30min后，加入胰蛋白酶水解2-4小时， 将酶解液于85°C恒温水浴15min，冷却至室温，离心15min，取上清液，干燥，得土鳖虫胰蛋 白酶酶解物； 步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫酶解物。
[0007] 优选的，所述土鳖虫酶解物的制备方法由以下步骤制成： A、 净选土鳖虫，粉碎成细粉； B、 向土鳖虫细粉中加入与土鳖虫细粉重量体积比为1 :20的人工胃液，密闭，于37°C恒 温水浴30min，加入2%胃蛋白酶水解2-3小时，得到胃蛋白酶酶解液，将胃蛋白酶酶解液，置 于85°C恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min， C、 取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物； D、取残渣加入20倍量人工肠液，密闭，于45°C恒温水浴30min后，加入4%胰蛋白酶水 解2-4h，将酶解液于85°C恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清 液，干燥，得土鳖虫胰蛋白酶酶解物； 步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫酶解物。
[0008] 为了实现上技术方案将所述的药物制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸 剂。
[0009] 具体方法和结果通过以下实验证实： 1仪器与试药 1. 1试剂 土鳖虫酶解物(实验室自制);人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC)(第二代，美国SCiencell 公司）；EMC培养基(含5%胎牛血清，1%内皮细胞生长因子，1%青霉素和链霉素）（美国 sciencell公司）;胰蛋白酶消化液(美国sciencell公司）;胰蛋白酶终止液(美国sciencell 公司）;MTT试剂盒(北京天恩泽基因技术有限公司）;3%H202溶液（同仁堂）;LDH试剂盒(南京 建成生物工程研究所）；雄性大鼠32只，体重150-200g。
[0010] 1.2 仪器 BB16UV/BB5060UVC02培养箱（Heraeus);40C型低速医用离心机(安心县白洋离心机厂)； Nikon Eclipse TE2000-5型电子显微镜；SHH.W21. 600型三用恒温水箱(上海树立仪器仪表 有限公司）;HFsafe 1500型超净台（上海力申科学仪器有限公司）；紫外线消毒车(江阴市光 电仪器有限公司）；DTY-2000型低速震荡仪(北京德天佑科技发展有限公司）；M 〇del 680型 酶标仪（BIO RAD) ;96孔板；移液枪；试管；移液管；枪头、尚心管等耗材。
[0011] 2 方法 2. 1细胞复苏 复苏细胞（由北京裕恒丰科技有限公司提供)。
[0012] 2. 2细胞传代 取培育好的细胞，弃去细胞培养基，加入胰蛋白酶2ml消化至细胞全部悬浮后，加2ml 胰蛋白酶终止液，混悬均匀吸到离心管中，1000 rpm离心5分钟，弃去上清液，加入3ml培养 基，用移液枪吹打制成单细胞混悬液，分装在三个培养瓶内，每瓶lml，再加入4ml培养基， 置于37°C、5%C0 2的培养箱。
[0013] 2. 3 MTT法-细胞毒性试验 2. 3. 1细胞处理 HUVEC细胞培养至对数生长期，加胰蛋白酶2ml消化至细胞全部悬浮后，加2ml胰蛋白 酶终止液，混悬均匀吸到离心管中，1000 rpm离心5分钟，弃去上清液。加 EMC培养基后吹 打制成单细胞混悬液，以1 :4接种于96孔板内。置于37°C，5%C02的培养箱。培养24h、48h 后，弃去上清液,加含 31. 25、62· 5、125、250、500、1000、2000、4000、8000 mg Γ1 土鳖虫活 性组分土鳖虫酶解物的培养基，每孔200μ 1。设不加药物的空白对照组和不接种细胞的阴 性对照组，空白和阴性对照组均加200 μ 1培养基。每组平行操作6孔。
[0014] 2. 3. 2 MTT 法测 OD 值 给药后放回培养箱继续培养24h，弃去上清液，每孔加入10 μ 1的MTT-A液，置于37°C， 5%C02的细胞培养箱中避光孵育4h，弃去上清液，每孔加100 μ I MTT-B液，将培养板置于低 速震荡仪振荡10分钟，490nm波长测定光密度（OD)值并计算细胞存活率。计算公式如下： 细胞存活率（％) =X 100% 2. 4细胞损伤模型的建立 HUVEC细胞培养至对数生长期，加胰蛋白酶2ml消化至细胞全部悬浮后，加2ml胰蛋白 酶终止液，混悬均匀吸到离心管中，1000 rpm离心5分钟，弃去上清液。加 EMC培养基后吹 打制成单细胞混悬液，以1 :4接种于96孔板内。置于37°C，5%C02的培养箱培养24h后，弃 去上清液，分别加入含〇. 6、0. 9、1. 2、1. 5、1. 8、2. 1、2. 4、2. 7 mmol L1H2O2的培养基。用不 加 H2O2的培养基做空白对照组。置于37°C的5% CO2培养箱中培养2h，在电镜下观察细胞 形态并采集图片。然后弃去各孔中培养基，另加入100 μ 1培养基和10 μ I MTT-A液，置于 37°C的5% CO2培养箱中，避光孵育4h，弃去各孔培养基，加100 μ I MTT-B液，置低速震摇仪 震摇lOmin，490nm检测OD值，计算细胞存活率。
[0015] 2.5 LDH (乳酸脱氢酶）漏出率的测定： 经L2mmol Γ1 H2O2 损伤后的细胞，分别加入含 250、500、1000、2000、4000 mg Γ1 土鳖虫酶解物的培养基，继续培养24、48h后，收集各孔上清液，然后向细胞中加入RIPA裂 解液150μ 1，分别收集上清液以及细胞裂解液，测其LDH含量。含量测定严格按照LDH试剂 盒操作。LDH漏出率计算公式如下： LDH 漏出率（％)= Χ100% 2. 6计算与统计 使用统计软件SPSS 17. 0对数据进行正态性检验，方差分析和双侧t检验，ρ〈0. 05数 据具有显著性差异。
[0016] 3结果与结论 3. I MTT检测给药浓度范围 土鳖虫酶解物在0?4000mg Γ1剂量范围内，培养24h和48h，细胞存活率均高于 80%，细胞毒性较小，如表1图1。因此选择4000 mg Γ1为最大给药浓度。
[0017] 表1 土鳖虫抗凝活性组分对HUVEC细胞毒性作用（）
【主权项】
1. 一种土鳖虫酶解物的应用，其特征在于所述土鳖虫酶解物在制备保护血管内皮细胞 药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述土鳖虫酶解物的制备方法由以下步骤 制成： A、 净选土鳖虫，粉碎成细粉； B、 将土鳖虫细粉置于人工胃液中，密闭，于37 °C恒温水浴30min，加入胃蛋白酶水解 2-3小时，得到胃蛋白酶酶解液，将胃蛋白酶解液置于85°C恒温水浴15min，冷却至室温，离 心， C、 取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物； D、 取残渣加入人工肠液，密闭，于45 °C恒温水浴30min后，加入胰蛋白酶水解2-4小时， 将酶解液于85°C恒温水浴15min，冷却至室温，离心15min，取上清液，干燥，得土鳖虫胰蛋 白酶酶解物； 步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫酶解物。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述土鳖虫酶解物的制备方法由以下步骤 制成： A、 净选土鳖虫，粉碎成细粉； B、 向土鳖虫细粉中加入与土鳖虫细粉重量体积比为1 :20的人工胃液，密闭，于37°C恒 温水浴30min，加入2%胃蛋白酶水解2-3小时，得到胃蛋白酶酶解液，将胃蛋白酶酶解液，置 于85°C恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min， C、 取上清液，干燥，得土鳖虫胃蛋白酶酶解物； D、 取残渣加入20倍量人工肠液，密闭，于45°C恒温水浴30min后，加入4%胰蛋白酶水 解2-4h，将酶解液于85°C恒温水浴15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清 液，干燥，得土鳖虫胰蛋白酶酶解物； 步骤C所得胃蛋白酶酶解物与步骤D所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫酶解物。
4. 根据权利要求1-3所述的应用，其特征在于：所述的药物的剂型为胶囊剂、片剂、颗 粒剂、散剂、口服液或丸剂。
【专利摘要】本发明公开了一种土鳖虫酶解物的应用,药物应用领域，在制备保护血管内皮细胞药物中的应用，由于目前动物药多以全粉入药，存在着剂量大、易造成微生物污染、用药剂量不当而引起敏反应、急性肝肾功能损害、溶血反应、中枢抑制和致畸等毒副作用，本发明只需要土鳖虫酶解物即可保护血管内皮细胞，效果好，降低了副作用的发生机率。
【IPC分类】A61K9-16, A61K35-64, A61K9-14, A61K38-01, A61K9-08, A61K9-48, A61K9-20, A61P9-14
【公开号】CN104548058
【申请号】CN201310503553
【发明人】赵韶华, 杜清华, 曹唯仪, 王玉蓉, 刘丽杰
【申请人】河北以岭医药研究院有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月24日