玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在改变植物抗旱性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属植物生物工程育种领域，具体说，涉及一种玉米分泌型磷脂酶A2基因 ZmsPLA2-2在改变植物抗旱性中的应用。
【背景技术】
[0002] 磷脂作为细胞膜的骨架成分，在细胞膜感受刺激并传递信息进入细胞的过程中发 挥十分重要的作用。当细胞膜上的受体接受外界信号后，受体激活相关酶将磷脂转变为信 号分子，如磷酸肌醇（phosphoinositides，PIs)、三磷酸肌醇（IP3)、二酯酰甘油 (diacylglycerol，DAG)、磷脂酸（phosphatidicacid，PA)、游离脂肪酸（freefattyacid， FFA)等，进而引发细胞内的一系列反应。磷脂信号参与光合作用、激素信号等调控，影响植 物生长发育过程及抗逆性。
[0003] 磷脂酶A(phospholipaseA，PLA)家族由磷脂酶A1 (PLA1)和磷脂酶A2(PLA2)两类 组成。二者分别在sn-Ι和sn-2位上催化磷脂的水解。其中PLA2催化磷脂生成sn-Ι位带酰基 链的溶血磷脂和自由脂肪酸(FFA)，广泛存在于细菌、植物、哺乳动物组织的细胞和分泌物 中。在植物中，PLA2参与了多种生命活动，如衰老、损伤、胁迫应答、病原体防御和诱导次级 代谢物积累等。PLA2可分为五种类型:分泌型PLA2(sPLA2s)，胞质Ca2+依赖型PLA2(cPLA2s)， Ca2+不依赖型PLA2(iPLA2s)，PAF酰基水解酶(PAF-AH)和溶酶体PLA2s。植物中未发现胞质 Ca2+依赖型cPLA2,其PLA2主要是sPLA2和与动物iPLA2同源的类patatinPLA2(PAT-PLA2)。 PAT-PLA2是PLA2和PLA1活性兼有的脂酰水解酶。植物特异性的PLA2是sPLA2。不同种类的 PLA2结构、功能各有不同，但其生理生化特性却有许多相似之处。
[0004]sPLA2基因的序列已经从多种植物中克隆得到。1999年，Kim等和S彳ahl等分别从康 乃馨和水稻中克隆到可能的sPLA2基因全序列（序列号分别为AF064732，AJ238116和 AJ238117)。2003年，Lee等和Bahn等对拟南芥数据库搜索发现与动物sPLA2同源的同工酶有 4个，分别为AtPLA2-a(At2g06925)、AtPLA2-0(At2gl969O)、AtPLA2-γ(At4g29460)和 AtPLA24(At4g29470)。其中，AtPLA2-a和AtPLA2-y有了较详细的研究。2010年，Liao和 Burns从甜橙中克隆到两个sPLA2基因CssPLA2-a和CsPLA2-0，并发现光调控这两个基因的 表达。
[0005] 植物SPLA2在氨基酸水平与动物SPLA2的相似性较低(约15% )，它们之间的Ca2+结 合环和活性位点元件相似性为50%。植物sPLA2可分为两个亚型：第一亚型有AtPLA2-a、榆 树的sPLA2、水稻的SPLA2-II和SPLA2-III、番茄和康乃馨sPLA2s，亚型内的氨基酸序列相似 性为47% ;第二亚型有AtsPLA2-i3、_γ、-δ和水稻的SPLA2-I，亚型内的氨基酸序列相似性为 54%。亚型之间的氨基酸序列相似性为29%。植物sPLA2包含PLA2的特征性结构域PA2C。该 结构域由Ca2+结合环(YGKYCGXXXXGC)和催化位点元件(DACCXXHDXC)组成。催化位点元件有 极保守的His/Asp二价体。在植物的Ca2+结合环上发现动物sPLA2中两个保守氨基酸残基， Tyr和Gly，它们参与氢键形成。在植物的SPLA2上也发现了介导蛋白分泌的N-端信号肽。洋 葱表皮细胞的瞬时表达分析发现AtPLA2-i3和AtPLA2- γ的确分泌到细胞间隙中。另外，AtPLA2-0、水稻SPLA2-I、甜橙CsPLA2-0分别在C-端有KTEL、KLEL和KFEL，这与内质网滞留序 列KDEL和HDEL极为相似。所有已鉴定的植物sPLA2s中都包含12个极为保守的半胱氨酸残 基，后者可能形成六对二硫键。动物sPLA2s的研究已表明这些半胱氨酸残基对酶的结构和 活性极为重要。sPLA2在内质网中切除信号肽后，以成熟形式分泌到细胞间隙。AtPLA2-i3和 AtPLA2-y的成熟形式的酶活性分别比加工前提高了2倍和1.3倍。这种变化归因于加工过 程中酶分子的结构重排。植物sPLA2最早从榆树种子胚乳中纯化得到(Stihl et al.，1998)。 它是一种15kD左右低分子量的水溶性蛋白，对热、酸、有机溶剂极不敏感，但对二硫键还原 剂极为敏感，活性需碱性pH和Cah^tPIJ^-a和AtPLA2_i3在沸水处理5分钟后仍然保持80-95%的活性，而在还原剂-511^〇1'1'存在时，活性仅为原来的35-65%(^七?1^2-€[^七?1^2-0、 AtPLA2-y和AtPLA2-S酶活的最适pH范围分别为pH6~11、ρΗ6~7、pH 7~9和pH 8~9,而 细胞间隙的pH为pH5~6，这表明AtPLA2- γ和AtPLA2-S可能在亚细胞定位处是失活的，其激 活需要升高pH<Xa2+浓度影响sPLA2s的酶活，随着Ca2+浓度升高到10mM，AtPLA2_a的特异活 性持续升高，而4丨?1^2-|3)丨?1^2-丫^丨?1^2-6在微摩浓度的0 &2+下酶活性已达到平台值。 榆树的sPLA2酶活性与Ca2+的关系与AtPLA2-a相似。AtsPLA2s酶活性需要的Ca2+浓度及pH值 不同，暗示在植物受外界刺激时sPLA2s的活性可能受Ca2+水平和pH值变化的调节。
[0006]关于PLA2的上游信号人们知之甚少，对哪种PLA2参与了某一特定的应答反应也了 解很少。有工作表明PLA2在植物对蓝光、生长素、非生物胁迫和病原体刺激的应答中被激 活。对于PLA2下游靶基因的研究，较多地依赖于从sPLA2的生化和分子特征分析推测。（1) PLA2可能在细胞内外的信号传导中发挥作用。PLA2的产物之一溶血磷脂酰胆碱在细胞中可 快速移动，可能是胞质内和细胞间信号传导的信使。有证据表明动物细胞中溶血磷脂酰胆 碱激活蛋白激酶，植物中也有多不饱和脂肪酸和溶血磷脂可激活蛋白激酶的报道。（2)PLA2 调控气孔开放。蓝光和红光可通过激活H+-栗诱导气孔开放，而这种效应可被sPLA2的抑制 剂抑制，说明sPLA2可能参与保卫细胞的光信号转导。与该设想一致的是在拟南芥中通过改 变AtsPLA2-i3基因的表达水平观察到气孔开放的变化，也证明AtsPLA2-i3调控光诱导的气孔 开放。（3)PLA2可能参与介导生长素诱导的细胞伸长。AtsPLA2-i3在幼苗和生长活跃组织中 表达强度较高，且受生长素诱导。Gilnther等(2007)指出PLA2在生长素调节的基因表达中发 挥重要作用。生长素激活PLA2,从而提高溶血磷脂和FFA的水平，激活H+栗。后者诱导质外体 酸化，促进细胞伸长。在幼苗和生长活跃组织中AtsPLA2-i3表达强度较高，且被生长素诱导。 AtsPLA2-邱勺过表达的确可以促进细胞伸长，产生伸长的叶柄和花序茎，而对该基因的RNAi 导致细胞伸长延滞。AtsPLA2-i3通过介导生长素诱导的细胞伸长在根的向地性反应中起着 重要作用。与之相一致的是，某些生长素依赖型的基因表达，其诱导可被PLA2抑制剂抑制， 说明PLA2在生长素调控的基因表达中发挥重要作用。在拟南芥根的研究中发现PLA2是生长 素流入载体PIN-FORMED蛋白运输到质膜所必需的。（4)PLA2在植物衰老中的作用。植物中 PLA2的产物溶血磷脂如溶血磷脂酰胆乙醇胺和溶血磷脂酰肌醇可特异抑制PLDa活性。已知 PLDa引起细胞膜损害而促进植物衰老。这表明溶血磷脂可能影响植物的衰老。外源施用LPE 的确可延迟不同植物器官的衰老。（5)PLA2在植物防御中有重要作用。PLA2作用于膜脂后可 产生游离的亚麻酸和亚油酸。它们可作为十八碳烯酸途径中脂氧合酶的底物，产生脂质过 氧化物，并进一步产生茉莉酸（」& 8!11〇11化，从）。从是植物防御反应中的重要调节子，作为系 统胁迫信号分子可以激活多种植物防御反应相关基因的表达，促进植保菌素积累和病原相 关蛋白的合成等，并可启动苯丙氨酸裂解酶基因的转录，调控查尔酮合成酶、营养贮藏蛋 白、富含羟脯氨酸的细胞壁蛋白等相关伤害防御基因的表达。尽管已知植物PLA2有如此重 要的生理功能，但是对于低分子量的分泌型PLA2(sPLA2)及其编码基因的性质了解很少。目 前已从拟南芥（Leeetal. ,2003)、康乃馨（carnation) (_S.tMi.letal·，1999)、水稻（Kimet al. ,1999)、甜澄(Citrussinensis)(LiaoandBurn,2010)中克隆到sPLA2基因序列。
[0007] 由sPLA2产物调控的下游信号可能包括蛋白激酶，H+-ATPase和PLDa，这些信号途 径介导如细胞伸长、重力反应、衰老、种子成熟、气孔开放和防御及胁迫应答等过程。PLA2的 水解产物脂肪酸和溶血磷脂已被证明可激发质膜上的一些酶如H+-ATPase、NADH氧化酶和 蛋白激酶，从而引发许多生理反应，如：活化膜上的H+、K+、Ca2+流动、产生活性氧，调节抗逆 基因的表达，调节胞内的pH值等。
[0008] 栽培植物的抗旱性提高无疑具有重要的经济价值和生态意义，是农业领域中的关 注课题。采用生物技术提高植物抗旱性已有众多工作，但仍是植物生物技术和农业领域的 研究热点，开发具有能显著提高植物抗旱性的基因有重要意义。
【发明内容】
[0009] 针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一种玉米分泌型磷脂酶A2基因 ZmsPLA2-2在改变植物抗旱性中的应用。
[0010]本发明所述的玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在改变植物抗旱性中的应用： [0011] 其