褐色橘蚜几丁质合成酶基因及其dsRNA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及昆虫的生长发育调控和基因工程领域，特别涉及一种褐色橘蚜几丁质 合成酶基因及其dsRNA。
【背景技术】
[0002] 褐色橘姐（Toxoptera citricida)是一种世界性的柑橘害虫，同时是柑橘衰退病 病毒的主要传播媒介，对柑橘产量和品质影响较大，目前化学防治仍是控制褐色橘蚜的重 要措施。化学农药施用不当，不仅影响果品安全，同时还会导致严重的抗药性。
[0003] RNA干扰（RNAinterference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默手段，是 指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA，Double-strandedRNA，双链核糖核酸） 诱发的、同源RNA高效特异性降解的现象，是通过dsRNA的介导特异性的降解对应序列的 mRNA。由于使用RNAi技术可以特异性抑制特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索 基因功能和基因治疗领域。
[0004] 几丁质是广泛存在于自然界的一种含氮多糖类生物性高分子，主要的来源为虾、 蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官，以及真菌类的细胞壁等。在昆虫中主要存 在于昆虫表皮层中的上表皮以及消化道的围食膜基质中，昆虫的变态发育依赖于体内几丁 质生物合成和降解的精确控制。几丁质在生物体内的合成是由一系列酶催化完成的，其中 几丁质合成酶（chitin synthase，CHS)在合成的最后一步起着关键作用，所以几丁质合成 酶的缺失可影响到昆虫的正常生长发育，由于人类、高等动物、植物并不含有几丁质，故几 丁质合成途径作为害虫的靶标相对安全，基于该途径研发新型的杀虫剂，应用于害虫的防 治具有很大的潜力，但是目前针对褐色橘蚜几丁质合成酶的相关研究较少，也未见针对褐 色橘蚜几丁质合成酶基因的dsRNA的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于克服已有技术的缺陷，提供一种褐色橘蚜几丁质 合成酶基因及其dsRNA。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] -种褐色橘蚜几丁质合成酶基因，其序列如SEQIDN0:3所示。
[0008] -种褐色橘蚜几丁质合成酶基因的dsRNA，其序列如SEQ ID NO: 6所示。
[0009] -种褐色橘蚜几丁质合成酶基因的dsRNA的合成方法，包括如下步骤：提取褐色 橘蚜的总RNA，反转录成为cDNA作为扩增模板，以序列为SEQIDN0:4的上游引物和以序列 为SEQIDN0:5的下游引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳后回收产物，以胶回收产 物为模板合成得到褐色橘蚜几丁质合成酶基因的dsRNA。
[0010] 在上述技术方案中，PCR扩增时25μ1的PCR反应体系包括：浓度为800-1200ng/ μ1 的cDNA模板 0· 5μ1，浓度为 0· 15-0. 25μΜ的上、下游引物各 1μ1，PrimeSTARMax Premix12. 5μ1以及去核酸酶水10μ1。
[0011] 在上述技术方案中，PCR反应条件为：95°C预变性3min;95°C变性30s、60°C退火 10s、72°C延伸5min，共35个循环；72°C条件下延伸lOmin。
[0012] 本发明的有益效果是：本发明鉴定得到褐色橘蚜几丁质合成酶基因序列，并根据 该序列得到几丁质合成酶基因的dsRNA，可以应用于对褐色橘蚜进行RNA干扰从而起到防 治褐色橘蚜的效果。通过实验验证，该dsRNA基因沉默效率高，基因干扰后褐色橘蚜有明显 表型变化，解决了褐色橘蚜目前没有有效的几丁质合成酶基因的dsRNA的问题，在研发新 型杀虫剂方面有很好的应用前景。
【附图说明】
[0013] 图1为褐色橘蚜CHS基因在NCBI中Protein Blast比对图。
[0014] 图2为褐色橘蚜及其它昆虫几丁质合成酶系统发育树图。
[0015] 图3为本发明实施例中的饲喂dsRNA的装置。
[0016] 图4为褐色橘蚜饲喂CHS基因的dsRNA后的CHS基因相对表达量，其中PBS表示 对照组，dsTCiCHS表示实验组。
[0017] 图5为褐色橘蚜饲喂CHS基因的dsRNA后的累积蜕皮率，其中PBS表示对照组， dsTCiCHS表示实验组。
[0018] 图6为褐色橘蚜饲喂CHS基因的dsRNA后的累积死亡率，其中PBS表示对照组， dsTCiCHS表示实验组。
[0019] 图7为褐色橘!??牙伺喂CHS基因的dsRNA后表型表现图；其中1为实验组的不能正 常蜕皮死亡的褐色橘蚜，2为对照组的能够正常蜕皮的褐色橘蚜。
【具体实施方式】
[0020] 本发明实施例所用化学试剂来源如下：
[0021] LATaq MIX(Takara公司，日本）
[0022] TRIzol kit (Invitrogen公司，美国）
[0023] RNeasy Plus Micro Kit (QIAGEN公司，德国）
[0024] PrimeSTAR Max Premix(Takara公司，日本）
[0025] 胶回收纯化试剂盒（Takara公司，日本）
[0026] Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo fisher Scientific 公司，美国）
[0027] Perfect real time RT reagent (Takara公司，日本）
[0028] GoTaCj1? qPCR Master Mix(Promega公司，美国）
[0029] TranscriptAid Enzyme Mix (Thermo fisher Scientific公司，美国）
[0030] ATP/CTP/GTP/UTP Mix (Thermo fisher Scientific公司，美国）
[0031] PrimeScriptRT Enzyme Mix I (Thermo fisher Scientific公司，美国）
[0032] Oligo dT Primer (Thermo fisher Scientific公司，美国）
[0033] Random 6 mers (Thermo fisher Scientific公司，美国）
[0034] 实施例一、褐色橘蚜几丁质合成酶基因序列鉴定
[0035] 1)从褐色橘蚜转录组数据（西南大学昆虫学与害虫控制重点实验室提供）中查 找可能的几丁质合成酶Unigene序列，通过tBlastn，在转录组当中查找到一条unigene序 列。
[0036] 2)利用RNA提取试剂盒RNeasyPlusMicroKit按照使用说明提取褐色橘蚜的总 RNA，然后利用反转录试剂盒PerfectrealtimeRTreagent按照使用说明将lyg总RNA 反转录成为cDNA。
[0037] 3)以上述得到的cDNA为模板，设计全长扩增引物，利用上下游引物CHS-A和 CHS-S进行PCR扩增；PCR条件为：95°C预变性3min;95°C变性30s、60°C退火10s、72°C延伸 5min，共35个循环；72°C条件下延伸lOmin。PCR反应体系共25μ1，包括：浓度为lOOOng/ μ1 的cDNA模板 1μ1，浓度为(λ15-0. 25μΜ的上下游引物各 1μ1，LATaqMIX(λ25μ1， 10XBuffer(Mg2+plus) 3μ1，dNTP4μ1 以及去核酸酶水 14. 75μ1 ;引物CHS-A(如SEQID NO: 1所示）和CHS-S(如SEQIDNO:2所示）的序列如下：
[0038]CHS-A：ATGACGTCTCTCCAGCGT,
[0039] CHS-S：TCAGTTAATGGCGTGCAT〇
[0040] 4)将PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳中进行分离，得到4700bp左右的条带，将PCR 产物送测序公司进行测序。
[0041] 5)将测序结果通过手工校对，序列拼接，并在NCBI中进行ProteinBlast相似 性比对，比对结果如图1所示，褐色橘姐几丁质合成酶基因与野豌豆姐（Apisglycines， 99% )的CHS基因同源性最高，然后是豌豆姐（Acyrthosiphonpisum，98% )CHS同源性次 之，也与半翅目的温带臭虫有较高的同源性。
[0042] 6)通过氨基酸系统发育树的构建，如图2所示褐色橘蚜的CHS基因氨基酸序列与 半翅目的蚜虫，褐飞虱，白背飞虱的聚到一枝，确定得到的序列为褐色橘蚜几丁质合成酶基 因序列（如SEQIDN0:3所示）。
[0043] 实施例二、褐色橘蚜几丁质合成酶基因的dsRNA的合成
[0044] 1)根据褐色橘蚜转录组数据（西南大学昆虫学与害虫控制重点实验室提供）， 设计扩增几丁质合成酶（CHS)基因的上下游引物T7-CHS-S1 (如SEQIDN0:4所示）、 T7-CHS-A1 (如SEQID勵:5所示），合成引物，引物序列分别为：
[0045]T7-CHS-S1：
[0046]TAATACGACTCACTATAGGGAGACGTAAAAACTGAAGAC；
[0047]T7-CHS-A1：
[0048]TAATACGACTCACTATAGGGCGTCCATGAAAATGTGAGT。
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