几丁质酶基因chiC及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种几丁质酶基因chiC，特别涉及一种 来源于假交替单胞菌的新菌株（Pseudoalteromonas sp. DL_6)(CGMCC No. 8580)的几丁质 酶基因chiC及其编码蛋白和应用。
【背景技术】
[0002] 几丁质（chitin)，俗称甲壳素，是一种可从虾蟹壳等废弃物中提取的天然多糖，其 结构为N-乙酰-D-氨基葡萄糖（50~100% )和少量D-氨基葡萄糖通过0 -1，4-糖苷键 (0~50% )连接而成，自然界中每年由生物体合成的甲壳素为100-1000亿吨，是海洋环境 中含量最丰富，自然界中仅次于纤维素的第二大生物质来源。几丁质降解产物为高附加值 的几丁寡糖、几丁单糖及其衍生物等，具有增强免疫力、抗肿瘤、抗菌、降血压和降低胆固醇 等生物活性，已广泛应用于医药、农业、工业和食品等众多领域。
[0003]目前，几丁质制备几丁寡糖普遍采用的方法是化学法，即用强酸去除盐类、蛋 白等，用强碱去除脂类或脱除乙酰基等。但是该工艺耗能大，反应过程及产物的分子量 分布难以控制，最重要的问题是生产过程中排放出大量的废酸碱水，造成了严重的环境 污染。因此，寻找一种绿色、高效高产高品质几丁寡糖的方法越来越受重视。几丁质酶 (chitinase, chi, EC3. 2. 1. 14)是指专一降解几丁质为几丁寡糖或单糖的一组酶的总称。 自然界中，chi广泛存在于细菌、病毒、真菌、昆虫、植物以及动物中，该酶具有重要的生理 功能，不同来源的chi，其催化机理和生理功能可能差别很大。细菌产生的几丁质酶可降解 几丁质产生碳源和能源，获取自身生长、繁殖所需养料，同时保证自然界中几丁质的循环利 用；真菌几丁质酶可实现自身细胞的分裂与形态构建；昆虫等节肢动物分泌几丁质酶满足 蜕皮和生长发育的需要；病毒几丁质酶在发病机制中产生；植物分泌几丁质酶却是为了防 御病源微生物的侵袭而进行的自我保护；一些原生动物需要几丁质酶消化昆虫的围食膜。 人类产生的几丁质酶功能尚未确定，据推测可能与抵抗体内几丁质源的病原体或在碳水化 合物代谢过程中发挥生理功能。
[0004]几丁质是海洋环境最丰富的资源，据估计10%的海洋细菌依赖几丁质作为碳源和 氮源，海洋具有高盐（3.5%)、高压（> lOOMpa)、低温、低光照、寡营养以及无光照、局部高 温（400°C)等极端生态环境，海洋低温chi具有低温下高酶活力及高催化效率、结构高效柔 顺性和热不稳定性等生物学特性。复杂多变的生态环境和遗传机制和遗传结构赋予海洋低 温chi产生特有的具有不同的聚合度（degree of polymerization，DP)几丁寡糖。几丁质 主要来源于海洋生物体，如虾、蟹和藻类和其他软体动物是，因此海洋中积聚着十分丰富的 几丁质资源。几丁质资源如果处理不好，不仅造成浪费而且污染环境。海洋低温几丁质酶 降解几丁质生产几丁寡糖及其衍生物解释了海洋环境几丁质物质循环的基本规律，不仅为 新型海洋微生物资源的开发与利用、海洋环境的保护与治理提供重要的理论依据，而且对 于开拓几丁质行业的市场具有应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明解决的技术问题是提供一种具有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的几丁质酶 基因chiC，并构建了 chiC原核表达载体，获得了高活性的几丁质酶。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的构思是：以假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas sp. DL-6) (CGMCC No. 8580)菌株为研宄对象，克隆和原核表达了几丁 质酶chiC基因，为获得高活性几丁质酶及具有几丁质酶的功能的产品提供了新思路。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] -种几丁质酶基因chiC，为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。
[0009] 上述几丁质酶基因chiC的扩增方法，以假交替单胞菌株（Pseudoalteromonas sp.DL-6)基因组DNA为模板，以引物对chiC-F和chiC-R进行PCR扩增；上游引物chiC-F: 5' -CCCGGATCCGGCGCCTTCTACACCAAGCATTAATTGG-3'，下游引物 chiC-R :5' -CCGCTCGAGAAGTG CTAACCATACATCGG-3'。
[0010] 本发明的第二个目的是请求保护一种由上述几丁质酶基因ChiC表达的几丁质 酶。
[0011] 所述的几丁质酶，具有如SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列。
[0012] 本发明的第三个目的是请求保护一种几丁质酶chiC的表达与纯化方法，步骤如 下：
[0013] (1)以PCR方法扩增如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；
[0014] (2)构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-chiC:将PCR扩增的DNA序列和pMD19-T simp 1 e载体用同样的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T4DNA连接酶连接 纯化的酶切产物，得到克隆载体pMD19-T-chiC;
[0015] (3)构建大肠杆菌重组表达载体pET28a-chiC:将克隆载体pMD19-T-chiC质粒转 化至E. coli DH5 a，得到阳性转化子，用限制性内切酶BamHI和Xhol将chiC基因片段从 pMD19-T-chiC质粒上切下，连接到pET-28a表达载体上，转化至E. coli BL21 (DE3)，通过菌 落PCR、酶切筛选鉴定阳性转化子，得到重组表达载体pET28a-chiC;
[0016] (4)构建大肠杆菌重组表达菌株此21(0￡3)1￡了28&-吐1(： :将重组表达载体 pET28a-chiC质粒转化至E. co 1 i BL21 (DE3)，挑选阳性转化子克隆，得到重组表达菌株 BL21(DE3)-pET28a-chiC ；
[0017] (5)体外诱导表达：将重组表达菌株BL21 (DE3)-pET28a-chiC接入含卡那霉素的 LB培养基中，于37°C过夜培养14h后，按1 %的接种量接种到含卡那霉素的LB培养基中，当 0D6Q(lnm= 0. 6-0. 8,加入终浓度为 0. 2mM 的 IPTG，于 30°C，lOOrprn 低温诱导 6h ;
[0018] (6)几丁质酶chiC的纯化：体外诱导表达结束后于4°C，5, 000 Xg离心5min收集 菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体三次，再用PBS缓冲液重悬菌体，之后置于冰上超声破碎三次， 每次30s，每次间隔lmin，然后于4°C，12, 000Xg离心20min收集上清液，即为粗蛋白，粗蛋 白用Ni2+-NTA柱进行亲和层析纯化，得到几丁质酶chiC。
[0019] 本发明还请求保护上述的几丁质酶在降解含几丁质底物中的应用。
[0020] 所述的几丁质酶chiC的应用，适宜的酶解条件为：酶解温度30°C，pH值为9. 0。
[0021] 所述的几丁质酶chiC对胶体几丁质具有高降解活性达1. 569±0. 017U/mL。
[0022] 所述的几丁质酶chiC降解a几丁质和0几丁质生成几丁二糖。
[0023] -种具有几丁质酶的功能的产品，具有如SEQIDNo. 4所示的氨基酸序列。
[0024] 本发明的有益效果是：
[0025] 1、本发明获得了几丁质酶基因chiC的序列，该序列首次在假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas sp.DL-6)中克隆；
[0026] 2、本发明构建了 chiC原核表达载体，成功获得分子量约92. 659kD的酶蛋白，得到 了具有高活性的酶，且制备过程简单，为chiC功能研宄提供了简便方法；
[0027] 3、本发明中几丁质酶chiC低温酶活高，酶解最适宜的反应温度为30°C，在pH = 6. 0~9. 0酶活较高，当pH = 9. 0达到最高，且生产成本低，产品易保存；
[0028] 4、本发明中几丁质酶chiC对胶体几丁质有较高的降解