花生几丁质酶基因启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了花生几丁质酶基因启动子及其应用，从花生基因组中扩增得到1611bp的启动子序列，命名为Ah-Chi-P，序列如SEQIDNo:1所示，根据该序列中预测的功能元件克隆该启动子的5'端系列缺失片段，分别得到5个缺失序列的启动子，经实验证明全长启动子及各缺失启动子片段均能够驱动GUS基因的表达，并且在水杨酸诱导后表达量有所提高，表明所述启动子均属于诱导型启动子。本发明利用花生几丁质酶基因的启动子序列分析其中的顺式作用元件，对通过调控实现花生内源几丁质酶基因的高效表达提供理论基础，同时为在花生遗传转化过程中特异诱导表达启动子的有效利用提供理论依据。
【专利说明】花生几丁质酶基因启动子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，具体涉及花生几丁质酶基因启动子及其应用。【背景技术】
[0002]花生在生产过程中易感染多种病害，如网斑病、褐斑病、黑斑病、锈病、青枯病等，严重影响其品质和产量，花生种质资源中缺乏对这些病害高抗或免疫的抗源。利用基因工程技术将相关抗性基因导入花生，通过过量表达外源基因使植物抵御病原菌的侵袭，是当今提高花生抗病性的有效策略。植物受病原菌侵染会诱导产生多种防卫反应，尤其是产生各种水解酶及病程相关蛋白(PR蛋白)，几丁质酶是PR蛋白中重要的水解酶，在植物抵御真菌性病害的防卫反应中发挥着重要作用。同时该酶受到病菌真菌(Phoma arachidicola)及激发子水杨酸分子(Salicylic acid, SA)等的诱导表达。
[0003]启动子是一段位于结构基因5’端上游的DNA序列，具有RNA聚合酶及相关转录因子的特异结合位点，它作为转录水平上一种重要的调控元件，是决定外源基因在转基因植物中表达的关键。真核基因的表达调控十分复杂，其中转录水平的调控最为重要，分析转录起始水平调控的基本出发点是鉴定基因上游启动子及研究启动子中顺式作用元件的特性，启动子中这些特异结合位点的鉴定是研究启动子驱动活性必不可少的工作。目前植物基因工程中常用的启动子如花椰菜花叶病毒35S (CaMV35S)启动子、水稻肌动蛋白基因(Actinl)启动子等都属于组成型启动子，在这些启动子驱动下的外源基因在转基因植物的所有部位和发育阶段均做同等水平的表达，这种外源基因的持续表达可能造成植物能量的损失，影响植物的生长发育，使毒性物质在植物体内积累。而诱导型启动子能控制基因在特定时期、特定部位表达， 这既避免了目的基因在组成型启动子驱动下在寄主细胞内高表达对寄主细胞生长的影响，又可使寄主细胞对特定的环境信号作出反应，因此发掘和利用诱导型启动子是使抗病基因有效利用的一种重要手段。目前已从多种植物中分离到病原物诱导启动子，这类启动子原来大多数属于植物防卫反应基因上游的调控序列。如来自野生烟草的β-1, 3-葡聚糖苷酶基因启动子,可受丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、欧文氏菌(Erwinia carotovora)诱导表达。拟南芥中可受立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)诱导的酸性几丁质酶基因启动子，在转基因番茄中同样能受番茄早疫病菌(Alternariasolani)的诱导表达,马铃薯渗透调节蛋白(Osmotin)启动子可受化学诱导物及马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)等多种因子诱导表达。激发子作为病原菌及植物相互识别的重要信号分子，能诱导植物的广谱抗性，可用于替代病原菌来研究诱导型启动子。而不同基因启动子存在着诱导驱动活性的差别，对外界环境的诱导反应有所不同，启动子内存在的对外界环境条件应答反应的调控元件亦有所区别。所以分离相关基因启动子、对启动子中的顺式元件进行功能分析是研究该基因表达调控及进一步有效利用的关键所在。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供了花生几丁质酶基因的启动子及其应用，本发明提供的全长序列启动子及缺失部分序列的启动子均属于诱导型的启动子，在水杨酸诱导下，其驱动的下游基因的表达量均有所提高。
[0005]为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现:
[0006]花生几丁质酶基因启动子Ah-Ch1-P，其具有序列表SEQ ID No:1所示的碱基序列。
[0007]花生几丁质酶基因启动子Ah-Ch1-Pl，其具有序列表SEQ ID No:2所示的碱基序列。
[0008]花生几丁质酶基因启动子Ah-Chi_P2，其具有序列表SEQ ID No:3所示的碱基序列。
[0009]花生几丁质酶基因启动子Ah-Chi_P3，其具有序列表SEQ ID No:4所示的碱基序列。
[0010]花生几丁质酶基因启动子Ah-Ch1-P4，其具有序列表SEQ ID No:5所示的碱基序列。
[0011]花生几丁质酶基因启动子Ah-Ch1-P5，其具有序列表SEQ ID No:6所示的碱基序列。
[0012]上述六种所述启动子是被水杨酸诱导的诱导型启动子。
[0013]本发明还提供了含有所述的花生几丁质酶基因启动子的重组载体。
[0014]本发明还提供了所述的启动子在驱动花生中几丁质酶基因和洋葱中GUS基因表达中的应用。
[0015]所述启动子Ah-Ch1-P驱动花生内源几丁质酶基因的表达，在水杨酸诱导后72h表达量有所提高；所述启动子Ah-Ch1-`P及相应缺失启动子Ah-Ch1-Pl、P2、P3、P4、P5在水杨酸诱导后84h，⑶S酶活性均得以提高。
[0016]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:植物几丁质酶属于一种重要的病程相关蛋白(PR蛋白)，容易受到激发子的诱导而积累。本发明首次在花生中克隆了几丁质酶基因上游启动子及其5’端系列缺失片段，通过转化洋葱表皮细胞及GUS染色证明该启动子是一个可被SA诱导的启动子，不同长度的缺失片段启动子经SA诱导后均能够驱动GUS报告基因的表达，不同启动子缺失片段驱动活性有所区别，但并不是片段越短活性越低，说明该启动子中存在对SA响应的正控制和负控制元件。当启动子长度为205bp时，就能够有效调控下游GUS基因的表达，推测其为核心启动子序列，在该序列内存在与转录有关的TATA-box、ff-box及对SA相应的顺式元件。
[0017]本发明克隆了花生几丁质酶基因的启动子序列并通过5’端缺失分析其中的顺式作用元件，对通过调控实现花生内源几丁质酶基因的高效表达提供理论基础，同时为在花生遗传转化过程中特异诱导表达启动子的有效利用提供理论依据。
[0018]结合附图阅读本发明的【具体实施方式】后，本发明的其它特点和优点将变得更加清
λ.Μ
/E.ο
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是花生几丁质酶基因荧光定量PCR分析的扩增曲线(图1A)及溶解曲线(图1B)。
[0020]图2是本发明使用1.5mmol.L^1SA处理下花生几丁质酶基因的表达量。[0021]图3是本发明引物组合SP1/AP3，SP2/AP3，SP3/AP3的三轮TAIL-PCR扩增结果，M:DL2000; I:SP1和AP3第一轮扩增产物；2:SP2和AP3第二轮扩增产物；3:SP3和AP3第
三轮扩增产物。
[0022]图4是本发明pMD18-T-Ah-Chi_P重组质粒PCR扩增及BamH I和Nco I双酶切鉴定结果，(△)]\1:01^2000;1，2:01^和 Ch1-R 引物对扩增条带；(B)M1 = DLlSOOOaj = BamH I 和Nco I双酶切产物；M2:DL2000。
[0023]图5是本发明所述Ah-Ch1-Pro启动子序列的功能预测，箭头表示引物序列及方向；下划线部分示推测的顺式调控元件序列，如=GTl-Hiotif在病原菌诱导的基因表达中起作用；GRWAAW参与水杨酸诱导基因的表达；TGACG与抗病反应有关。
[0024]图6 是本发明植物表达载体 pCAMBIAl301-xyIA-Ch1-P、PU P2、P3、P4、P5PCR 扩增(A)及BamH I和Nco I双酶 切验证(B)结果。(A) M:DL2000 ;CK为未加模板对照；P、P1、P2、P3、P4、P5分别为几丁质酶全长启动子及5’端系列缺失启动子PCR扩增片段(B) M:DL15000 ;P、P1、P2、P3、P4、P5分别为几丁质酶全长启动子及5’端系列缺失启动子BamH I和Nco I双酶切结果。
[0025]图7是本发明转基因洋葱表皮细胞⑶S染色结果(a-c未经SA诱导，e_i由
5.0mmol ^U1SA诱导84h)，其中a:非转基因洋葱表皮细胞⑶S染色结果；b =Ah-Ch1-P未经SA诱导时驱动⑶S染色结果；c:35S驱动⑶S染色结果；d =Ah-Ch1-P经SA诱导后驱动⑶S染色结果；e =Ah-Ch1-Pl驱动⑶S染色结果；f:Ah-Ch1-P2驱动⑶S染色结果；g:Ah_Chi_P3驱动⑶S染色结果；h =Ah-Ch?-Ρ4驱动⑶S染色结果；i:Ah-Ch1-P5驱动⑶S染色结果。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不限于本发明的范围。
[0027]实施例1
[0028]本实施例具体包括以下试验过程:
[0029]1.1试验材料
[0030]植物材料为花生品种西洋生和洋葱。大肠杆菌(E.coli)DH5a、根瘤农杆菌EHA105 和 pCAMBIA1301 质粒均购自 TaKaRa 公司；PrimeScript TMlst Strand cDNASynthesis Kit 试剂盒、Genome Walking Kit 试剂盒、pMD18_T 克隆载体、BamH 1、Nco 1、r Taq、T4连接酶均购自TaKaRa公司；EZ_10Spin柱式DNA凝胶回收试剂盒和SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、X-gluc等购自上海生工生物公司；RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒购自青岛艾德莱生物公司。
[0031]1.2水杨酸诱导花生幼叶
[0032]利用1.5mmol.L—1水杨酸溶液(SA, PH=7.0)中加入0.1%的Tween20以增加药剂与喷雾叶片的粘附性，对照为0.l%Tween20o供试材料西洋生幼苗生长到3至4片叶时，喷施SA溶液至供试叶片的正反两面，直至整株叶片全部湿润，室温下处理0h、12h、24h、36h、48h和72h后采收4片叶，液氮速冻后，_80°C保存备用。对照植株喷施含0.l%Tween20的水溶液。
[0033]1.3花生总RNA的提取和荧光定量PCR检测[0034]提取花生叶片总RNA，反转录成cDNA。采用两步法在ABI7500FAST型荧光定量PCR仪上进行反应。花生内参肌动蛋白基因(Ah-Actin)引物为Actin-F、Actin-R (引物序列见表1)。几丁质酶基因(Ah-Chi)扩增引物为Ah-Ch1-F、Ah-Ch1-R (表1)。扩增程序为:95°C预变性2min ;95°C变性10s，60°C延伸40s，40个循环；缓慢升至95°C，制备溶解曲线。每个反应2个重复。相对表达量的计算参照Livak的2_(λ Δε?)法。
[0035]水杨酸诱导后花生几丁质酶基因的表达量如图1所示，由图1A可以看出花生几丁质酶基因(Ah-Chi)扩增曲线呈规则的S形，基线平整、指数区明显，复孔间扩增曲线基本重叠，说明扩增曲线良好。Ah-Chi的溶解曲线显示单一的特异峰(图1Β)，说明扩增产物特异性高，无引物二聚体及非特异性扩增。由图2显示，花生幼叶用SA诱导72h内Ah-Chi的表达量总体呈现升高的趋势，前48h Ah-Chi的表达量升高并不显著，在诱导后72h Ah-Chi的表达量急剧升高并且达到最高值，是未经SA诱导表达量的4.47倍。说明外源SA诱导可增加花生幼叶中Ah-Chi的表达量，花生几丁质酶基因的启动子是诱导型的启动子。
[0036]1.4花生几丁质酶基因全长启动子的克隆
[0037]根据花生几丁质酶基因cDNA (Genebank HQ439775) 5’端序列，设计3个嵌套的特异性引物SP1、SP2、SP3(表1)，与Genome Walking Kit试剂盒中的4个随机引物AP1、AP2、AP3、AP4分别组合，以西洋生基因组DNA为模板进行TAIL-PCR扩增。结果如图3所示，3个嵌套的特异性引物SP1、SP2、SP3与AP3引物组合在第3轮反应后扩增出I条约1710bp特异条带(图3)，与AP1、AP2、AP4组合均未扩增出特异性条带。1710bp特异条带经回收测序后与几丁质酶基因cDNA5’端序列能够正确拼接，命名为:Ah-Ch1-Pix)。
[0038]根据Ah-Ch1-Pro测序结果设计引物Chi_F、Chi_R (表1)，以西洋生基因组DNA为模板进行扩增，得到大小为1611bp的序列，命名为Ah-Ch1-P(简称启动子P)。将Ah-Ch1-P连接到PMD18-T载体，重组质粒经PCR扩增得到161 Ibp片段(图4A)I和Nco I双酶切，获得1611bp的启动子`片段及大于2000bp的载体大片段(图4B)。所述1611bp的启动子P序列如下(SEQ ID No:1)所示:
[0039]A GCATTTCCCT ACTTTACGTA TTCTCTTTAT TGGTCACGGC AAAGACTTAA
[0040]GAAAAGACTT AGTCAAGTCT AGCTAACATA AGCAGACATA AATCTATGTG ACATATCGAC
[0041]GGTCCATATG AAAAAGAAAT GATAGTTCTG TCTTAGAATT AAGAAAATAA AGTAAATTAT
[0042]TAATCCAGAA GTATTACTTT TCCGTATCTG AAAAATCTCA ATCTAATGAG ATAAGGGGAC
[0043]GGTGCAGCCT TTTTGTCAAA ATTCGAACTA AGAGTCACCA TTTTGTTAGA ACGCTTCATC
[0044]AGCTTATATA ACACAATTCC TCCACTTCAC GGCATTGATA TAGTCAATTT TGTGGGGCAC
[0045]AAAAGAAAAG AAAGTCTTTG AACTCTTTGG AGTGTTATTC ATCAATTGAA ACCTGAATGC
[0046]AATTTTTTTT TCTTGTTAGA GGAGACCAAA ATATCACATG TTTCAAGATG CTAGAATTCA
[0047]CTCGCCATGA TTTGGAAAAC AACTAAATTT GGTGTATTAA TCATATTGGG CTAGAATTGC
[0048]TTTTCATATA CGTATGTTAA TGGAATAAAA CAATAACTTC ATATTTATTA AAAAATTAAA
[0049]TTAACTCTAT TTGTCTATTT TTTAACAAAT TTATGGTAGT TGCATTCTGA TGGTTTGAGA
[0050]GCAAAACTTA TTCTTCTTTT GCGCGTACCA GTTCTATAAG TGCATCAAAA GTTTTCGAAT
[0051]TAGATGAGTT TTAGAGCAAA AAATAAATAA AAAAACACCA AAAAGATAAA AGAAGTGTAA
[0052]AAGAAAAAAT TCGAAAAGTA AATTGATTAA AATCGAAAAA TGTTTACATT AAATTTAAAC
[0053]AAAGCAGTAA AATGCATTCG ATTGAATTAA AGGACTTTTG ACATAGAAAT TAAAGATGTT
【权利要求】
1.花生几丁质酶基因启动子八其具有序列表SEQID No:1所示的碱基序列。
2.花生几丁质酶基因启动子其具有序列表SEQID No: 2所示的碱基序列。
3.花生几丁质酶基因启动子其具有序列表SEQID No: 3所示的碱基序列。
4.花生几丁质酶基因启动子其具有序列表SEQID No:4所示的碱基序列。
5.花生几丁质酶基因启动子其具有序列表SEQID No: 5所示的碱基序列。
6.花生几丁质酶基因启动子其具有序列表SEQID No:6所示的碱基序列。
7.根据权利要求1-6任一项所述的启动子，其特征在于所述启动子是被水杨酸诱导的诱导型启动子。
8.含有权利要求1-6任一项所述的花生几丁质酶基因启动子的重组载体。
9.根据权利要求1-6任一项所述的启动子在驱动花生中几丁质酶基因和洋葱中^浴基因表达中的应用。
10.根据权利要求9所述的启动子在驱动花生中几丁质酶基因和洋葱中基因表达中的应用，其特征在于，所述启动子驱动花生内源几丁质酶基因的表达，在水杨酸诱导后72h表达量有所提高；所述启动子必-G1-P及相应缺失启动子必-a1-W、P2、P3、P4、P5在水杨酸诱导后84h，`⑶S酶活性均得以提高。
【文档编号】C12N15/113GK103820456SQ201410092152
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】乔利仙, 陈新利, 宋汝涛, 隋炯明, 王晶珊 申请人:青岛农业大学