一种杜仲几丁质酶编码基因（EuCHIT1）及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，主要关于杜仲抗真菌几丁质酶（EuCHITl)及 编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 杜仲（EucommiaulmoidesOliver)是杜仲科杜仲属植物雌雄异株，在我国被利用 的历史可以追溯到公元二世纪的《神农本草经》，具有双向调节血压、抑菌和抗菌效用，具有 重要的药用价值。鉴于其起源古老，在科学上具有重要的研究价值，目前对杜仲的研究主要 集中在血压调节物质，杜仲胶合成途径相关基因的克隆和抗菌物质的化学分离方面。早期 研究表明从杜仲中提取的总蛋白对多种植物病源真菌的生长具有明显的抑制作用，并且从 中分离到的杜仲抗菌肽EAFP1和EAFP2含有几丁质结合结构。几丁质酶广泛的存在于动植 物及微生物的细胞和组织中，以几丁质为底物将其水解成寡聚糖再进一步水解为N-乙酰 氨基葡萄糖，高等植物不含作为真菌细胞壁组分之一的几丁质，但当植物受到真菌、细菌和 病毒等感染时，植物几丁质酶的转录表达量迅速提高。因此普遍认为几丁质酶是植物重要 的病程相关蛋白（pathogenesis-relatedprotein，PR)。目前多种植物的几丁质酶基因序 列被克隆，如白杨、蚕豆、小麦、水稻、甜菜、烟草、马铃薯、棉花等，但对杜仲几丁质酶基因的 研究尚未见报导
【发明内容】
[0003] 针对上述领域中的空白，本发明提供一种杜仲几丁质酶，对植物真菌病害的防治 有明显的作用。
[0004] 本发明的目的之一是提供一种杜仲几丁质酶。
[0005] 本发明另一目的是提供编码上述杜仲几丁质酶的基因序列。
[0006] 本发明另一目的是提供上述杜仲几丁质酶的编码基因在植物基因工程中的应用。
[0007] 杜仲几丁质酶（EuCHITl)，其氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示。
[0008] 编码上述杜仲几丁质酶的基因。
[0009] 所述编码杜仲几丁质酶的基因序列如SEQIDN0 :1所示。
[0010] 杜仲几丁质酶的表达载体，含有编码上述杜仲几丁质酶的基因。
[0011] 所述表达载体的骨架载体为PSH-35S。
[0012] 杜仲几丁质酶的生产方法，将编码杜仲几丁质酶的基因转化植物，使其表达杜仲 几丁质酶，利用生物反应器生产杜仲几丁质酶，再提取得到。
[0013] 所述转化为将上述表达载体转化根瘤农杆菌LBA4404,遗传转化烟草。
[0014] 杜仲几丁质酶的编码基因在植物基因工程中的应用。
[0015] 所述应用为将编码杜仲几丁质酶的基因转化植物，使植物表达对真菌病害的抗 性；或者所述应用为将杜仲几丁质酶作为药效成分制成药剂用于防治真菌病害。
[0016] 所述真菌为镰刀菌或灰霉菌。
[0017] 本发明提供一种杜仲几丁质酶及其编码基因与应用，根据已经构建的杜仲转录组 注释的几丁质酶基因部分序列，设计RACE扩增引物，提取杜仲的总mRNA反转cDNA为模板， 扩增基因的5'端和3'端序列，经过overlap拼接获得全基因序列，根据拼接结果设计开放 阅扩增引物。开放阅读框编码的氨基酸序列，经过NCBI同源比对后发现与刺槐的几丁质酶 的同源性为84%。在对几丁质酶基因进行生物信息学分析基础上，构建植物表达载体遗传 转化烟草。提取烟草总蛋白进行抑菌试验发现与野生型烟草相比，该转基因烟草对镰刀菌 这一植物病原真菌的生长具有抑制作用，故该基因可以用于对植物真菌病害的防治中。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明实施例1中杜仲几丁质酶基因5' -RACE和3' -RACE PCR产物电泳 图；
[0019] 图2是本发明实施例1中杜仲几丁质酶几丁质结合和催化位点预测图；
[0020] 图3是本发明实施例1中杜仲几丁质酶磷酸化位点预测图；
[0021] 图4是本发明实施例1中杜仲几丁质酶信号肽预测图；
[0022] 图5是本发明实施例1中杜仲几丁质酶进化树分析图；
[0023] 图6是本发明实施例1中杜仲几丁质酶基因开放阅读框PCR扩增图；
[0024] 图7是本发明实施例1中杜仲几丁质酶遗传转化烟草过程图；
[0025]图8是本发明实施例1中转杜仲几丁质酶烟草蛋白提取物体外抑菌试验图（镰刀 菌）；
[0026] 图9是本发明实施例1中转杜仲几丁质酶烟草蛋白提取物体外抑菌试验图（灰霉 菌）。
【具体实施方式】
[0027] 为了更为清楚的解释本发明的目的和技术方案以及优点，结合附图对本发明进一 步详细的说明。此处描述的具体的实施方法仅仅用以解释本发明。
[0028] 本实验使用贵州农业生物工程重点实验室试验示范基地种植10余年生杜仲为材 料，采集雌雄株幼芽、叶片、幼枝、树皮及雌株幼果提取总RNA，反转cDNA。
[0029] 总RNA的提取采用omega公司的Ε. Ζ· N, A.*Plant RNA Kit的困难样本说 明进行，提取样本经无水乙醇洗涤2次去除多余的盐分，最終提取产物溶于适量的 40ul Rnase-free水中，-80 °C保存。5' -和3' -RACE-Ready cDNA的制备方法参照 SMARTer?RACEcDNA Amplification Kit说明书制备。
[0030]1)3 ' 端和 5 ' 端RACE扩增
[0031] 根据己构建的杜仲转录组文库中已有的杜仲几丁质酶的部分序列，经过NCBI数 据库blastp比对后选取与其它植物几丁质酶同源性较高的序列作为overlap，设计5'-和 3'-RACE扩增的引物，引物的各项参数符合SMARTer?RACEcDNAAmplificationKit的各 项要求，引物质量评估使用DNAStar7. 10,引物序列为：
[0032] EuCHITlGSPl:5'CCTGGATTCGGTACCACTATGAATGTCCC3'；
[0033] EuCHITlGSP2:5' GCTTGGGTTGAAAGGAAGCTGCTCG 3'
[0034] 几丁质酶基因RACE PCR扩增体系及程序：
[0035] PCR管中建立50yL反应体系，依次加入下列成分：34. 5yL PCR-Grade Water; 5. 0 μL 10 X Advantage 2 PCR Buffer；1.0μ1 dNTP Mix(lOmM)；1.0μ1 50X Advantage2 Polymerase Mix混匀切勿产生气泡。继续加入2.5yL 5'（3'）-RACE-Ready cDNA，5yL 10 XUPM，1 μ LGSP2 (GSP1)，终体积50 μ L。混匀后按下列程序进行PCR扩增：94 °C、30s; 72 °C、2min、5cycles ;94 °C、30s ;70 °C、30s ;72 °C、2min，5cycles ;94 °C，30s，68 °C，30s， 72°C，2min，25cycles。取4yL产物凝胶电泳检测，扩增结果如图1所示。开放阅读框预测 及序列分析。
[0036] 50ulPCR产物 1 % 的琼脂糖凝胶（BIOWESTRE⑶LARAGAROSEG-10)电 泳。Ε·Ζ·N.A.GelExtractionKit切胶回收纯化，获得片段连接至pGEM-TEasy Vector(PromegaCorporation)载体上，转化大肠杆菌感受态细胞（DH5a)。以氨节青霉 素（Ampicillin，Amp)和 5_ 漠 _4_ 氣 _3_ 吲噪-β-D-半乳糖昔（5-Brom〇-4-chlor〇-3_i ndolylβ-D-galactopyranoside，X_Gal)、异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-l-thioga lactopyranoside，IPTG)作为筛选标记筛选阳性单菌落，经酶切和PCR鉴定后送北京诺赛 基因组研究中心有限公司测序。RACE扩增获得大小分别为1076bp和512bp的5'-RACE和 3' -RACE扩增产物，测序结果SERIALCL0NER2. 1分析，通过overlap拼接获得全长1402bp 杜仲几丁质酶基因1 (EuCHITl)，138-140bp处为ATG起始密码子，1104-1107bp为TGA终止 密码子，开放阅读框长（OpenReadingFrameFinder，0RF)969bp，编码322个氨基酸。开 放阅读框编码的氨基酸序列NCBIblastp分析发现，EuCHITl编码的是植物几丁质酶属于糖 苷水解酶19家族，含有该家族的7个保守几丁质结合和催化位点，故推断该基因编码的蛋 白可能具有几丁质酶的活性（图2)
[0037] 2)生物信息学分析
[0038] ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)对该基因编码蛋白的理化性质进 行预测发现该蛋白的分子量为35. 3KD，等电点（PI) 6. 64、稳定指数为34. 57、亲水性的评 估为-〇. 242可知该基因编码的是一个亲水的稳定性蛋白。NetPh0S2.oserver(http:// www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析表明该蛋白可能含有5个丝氨酸磷酸化位 点，7个苏氨酸磷酸化位点和6处酪氨酸磷酸化位点如图3所示。PoleBioinformatique Lyonnaise(https://npsa-prabi.ibcp.fr)对蛋白的二级结构进行分析的结果发现，该基 因编码的蛋白是由a_螺旋（Alphahelix)、随机卷曲（Ramdomcoil)和延伸链（Extended Strand)三种蛋白的二级结构构成，并且a-螺旋和随机卷曲之间是通过延伸链连接。 SignalP4.1Server分析发现该蛋白含有信号肽的片段，故推断该蛋白是一个胞外分泌型 蛋白（图 4)。TargetP1.lServer(h