一种禽流感全病毒颗粒标记疫苗的制备方法及其产品和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种禽流感标记疫苗的制备方法及其产品和用途，特别涉及一种通过 MDCK细胞悬浮培养禽流感病毒、以及采用新的浓缩纯化方法制备禽流感标记疫苗的方法， 还涉及标记疫苗的质量标准和检定。本发明属于医药生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 疫苗接种是特异性预防禽流感病毒（AIV)的有效手段，制备安全有效的疫苗是成 功地预防、控制乃至最终消灭AIV的先决条件。疫苗使用的效果取决于快速大量疫苗的生 产和供给，最近几年的流感流行和新的流感病毒爆发流行提示及时的疫苗接种是控制、预 防流感的最重要措施。但是各地流行的高致病性禽流感亚型不同，疫苗株和流行株的抗原 性不匹配或匹配程度低，给疫苗的开发和研制带来的极大挑战。目前国内鸡胚禽流感疫苗 存在的问题，主要为：
[0003] 1)疫苗诱导抗体妨碍识别感染和免疫禽类；
[0004] 2)疫苗预防禽流感发病而不能预防阴性感染；
[0005] 3)免疫产生的压力促使禽流感病毒抗原突变逃逸免疫；
[0006] 4)免疫保护产生的时间晚，免疫保护期短；
[0007] 5)母婴抗体对新生禽类免疫的干扰；
[0008] 6)疫苗对各种禽类的免疫效果不是很清楚；
[0009] 7)疫苗的质量：安全性、免疫原性、有效性、稳定性有待提高。
[0010] 用鸡胚生产禽流感疫苗，鸡胚供应和生产周期长，难以应对新发禽流感的防控；传 统的兽用流感疫苗由于采用鸡胚规模化生产，疫苗尽管安全但容易引起严重的应急反应， 需要对工艺进行改造、验证。
[0011] 禽流感病毒灭活疫苗具有良好的免疫原性，在预防和控制禽流感的过程中发挥着 重要作用，但在疫苗制备过程中和产品中的一些宿主细胞蛋白残余、核酸、牛血清白蛋白、 化学试剂等如果不加以控制，则会引起免疫动物产生严重副反应甚至死亡，特别是可能使 动物致癌或影响肉类动物的食品安全。
[0012] 用宿主细胞MDCK培养病毒制备疫苗抗原或重组药物，从用药安全性考虑，必须 纯化抗原去除影响禽流感病毒疫苗安全性的杂质，以使其符合药品质量规范和安全要求， 同时尽量减少工艺或原辅材料中可能潜在的影响疫苗效果和安全的物质，特别是要尽量避 免使用动物源性的原辅材料，以降低传播动物疫病如流感、犬瘟热、疯牛病、狂犬病等传染 病风险。
[0013] 用生物反应器生产禽流感病毒抗原，提高了细胞密度、病毒抗原产量，同时增加了 细胞杂质和添加物的量，也增加分离、浓缩、纯化禽流感病毒的工艺步骤。过去因为禽流感 病毒疫苗抗原库主要以鸡胚作为抗原生产基质，疫苗多为粗制疫苗。纯化技术特别是现代 规模化浓缩、纯化病毒抗原技术，如柱层析、蔗糖梯度超速离心技术、切向流中空纤维柱、深 层过滤模块几乎没有在兽用疫苗生产中使用。这些技术和设备的应用易于疫苗质量控制和 保证，也易于GMP认证和工艺验证。
[0014] 现行生产灭活禽流感病毒抗原采用MDCK细胞为疫苗抗原生产基质，MDCK细胞悬 浮培养后继灭活、浓缩工艺达到部分纯化，后经乳化制成疫苗供使用。尽管该疫苗的免疫效 果达到疫苗规程要求，但按现代疫苗的安全性要求，杂质含量高、总蛋白含量高，有效完整 病毒颗粒含量低，对有效抗原量、MDCK细胞DNA残余、MDCK细胞蛋白残余、牛血清白蛋白、灭 活剂、防腐剂以及生产过程化学添加物没有明确界定和定量。疫苗的质量标准和工艺应不 断提高，以保证疫苗稳定、安全、有效。
[0015] 纯化禽流感疫苗配方中禽流感M2蛋白含量甚微，且在各型流感病毒中高度保守， 含高度纯化灭活完整禽流感病毒颗粒的疫苗，不引起动物产生抗M2抗体，而自然感染或隐 形感染禽流感动物产生M2蛋白抗体，因此通过检测动物体内的M2非结构蛋白的抗体存在 与否，可区别动物禽流感疫苗免疫和自然感染，发挥禽流感防控的免疫和检测作用。
【发明内容】
[0016] 本发明的目的在于提供一种大规模制备禽流感全病毒颗粒标记疫苗的方法及其 广品和用途。
[0017] 本发明的一种禽流感全病毒颗粒标记疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步 骤：
[0018]a)病毒培养
[0019] 10000L生物反应器全悬浮培养MDCK细胞，细胞密度达到3-5X106个/ml，按照感 染复数Μ0Ι0. 01-0. 1接种禽流感病毒MDCK细胞适应株，加入胰酶，使其终浓度达到50μg/ mL，搅拌速度不超过40rpm，4天收获病毒液，用制备型低速连续流离心机离心除去细胞碎 片，同时收获上清液和沉淀；沉淀在Triton-X-100存在的条件下裂解禽流感病毒感染细胞 和细胞膜碎片，所述Triton-X-100的终浓度为1-2% (v/v)，反复冻融3次后超声3次，用 制备型低速连续流离心机离心收集上清液，合并上清液；
[0020] 该步骤的质量控制指标为：禽流感病毒滴度为多107l〇gTCID5(]/mL，禽流感病毒血 凝素含量为彡30μg/ml，TritonX-100残余量彡600μg/ml，抗生素残余量为彡180μg/ ml；
[0021] b)膜深层过滤、微滤、超滤
[0022] 步骤a)得到的病毒上清液，依次经过0. 65微米的膜深层过滤以及0. 45微米孔径 的滤膜微滤后，经膜孔截留值为750, 000-1000, 000MWC0的切向流超滤膜超滤，进一步除去 完整的MDCK细胞和大分子物质；
[0023] 该步骤的质量控制指标为：禽流感病毒滴度为多107logTCID5Q/mL，禽流感病毒血 凝素含量为彡20yg/ml，内毒素含量<40EU/ml，；
[0024] c)灭活；
[0025]甲醛灭活，灭活条件：2-8°C，时间7-10天；灭活澄清液经膜孔截留值为 750, 000-1000, 000MWC0的切向流超滤膜超滤，进一步除去小分子杂质和缩小体积以便纯 化；
[0026] 该步骤的质量控制指标为：禽流感病毒血凝素含量为彡20μg/ml，Triton-X-100 残余量< 50μg/ml，甲酸残余量< 300μg/ml;内毒素含量< 40EU/ml
[0027]d)亲和层析以及在柱核酸酶解：
[0028] 包括：（1)采用硫酸纤维素或肝素作为亲和层析介质，将灭活后的禽流感病毒澄 清液吸附在介质上，洗脱细胞DNA和细胞蛋白；（2)经过步骤（1)操作后，用非特异的核酸 酶进行在柱酶解；（3)经步骤（2)操作后洗涤层析介质，洗脱禽流感病毒；
[0029] 该步骤的质量控制指标为：体积为2000L，禽流感病毒血凝素含量多100μg/ml， MDCK细胞蛋白残余量<50ng/ml，MDCK细胞残余DNA量< 1000pg/ml，M2蛋白含量< 100ng/ ml，牛血清白蛋白残余量< 100ng/ml，Triton-X-100残余量< 50μg/ml;甲醛残余量 < 50μg/ml，内毒素含量< 30EU/ml;
[0030] e)疏水反应层析
[0031] 步骤d)洗脱后的禽流感病毒液上样于苯基琼脂糖疏水层析柱，洗脱禽流感病毒， 得到纯化后的禽流感病毒液；
[0032] 该步骤的质量控制指标为：体积为2000L，禽流感病毒血凝素含量多100μg/ml， MDCK细胞蛋白残余量< 30ng/ml，MDCK细胞残余DNA量< 500pg/ml，M2蛋白含量< 50ng/ ml，牛血清白蛋白残余量< 50ng/ml，Triton-X-100残余量< 50μg/ml;甲醛残余量 < 50μg/ml，内毒素含量< 30EU/ml;
[0033] f)透析、除菌过滤
[0034] 经步骤d)纯化后的禽流感病毒液稀释为10000L，进行透析，透析后的病毒液经 0. 22μm膜除菌过滤；
[0035] 该步骤质量控制指标为：禽流感病毒血凝素含量多40yg/ml，内毒素含量 < 10EU/ml，MDCK细胞蛋白残余量< 10ng/ml，MDCK细胞DNA残余量< 100pg/ml，甲醛残余 量< 50μg/ml，TritonX-100残余量< 5μg/ml，禽流感M2蛋白含量< 10ng/ml，牛血清白 蛋白残余量< 20ng/ml;
[0036]g)乳化：采用适宜的水包油包水佐剂进行乳化即得。
[0037] 在本发明中，优选的，步骤d)中用非特异的核酸酶在柱酶解包括按每毫升病毒液 加入1-100单位的量，将非特异性、高活性的核酸酶加入到层析介质中，2-8°C作用9-18小 时。
[0038] 在本发明中，优选的，步骤e)中所述的透析采用的透析液中含有蔗糖6% (w/v)、 单盐酸精氨酸1% (w/v)、一水谷氨酸钠0.05% (w/v)、水解明胶0.5% (w/v)、无水磷酸氢 二钾1%(￥八）以及磷酸氢二钾0.25%(￥八）。
[0039] 在本发明所述的方法中，优选的，步骤f)中所述的乳化采用的佐剂包括细胞因 子、油乳佐剂和合成佐剂，优选为ISA25、QS-21、MF59以及铝佐剂。
[0040] 如上，本发明提供了一种投入/产出效果明显的，用于制备高效、高纯度的完整禽 流感全病毒颗粒标记疫苗的方法。本发明与纯化流感病毒方法以及质量控制方法、质量标 准，特别是新的纯化方法和质量控制有关（图1和图2)。
[0041] 1、溶解宿主细胞
[0042] 由于禽流感病毒在MDCK细胞中增殖，形成细胞病变裂解了细胞，部分病毒释放， 部分病毒在细胞内或细胞碎片上，本发明采用连续低速离心机收集病毒上清，对沉淀进行 超声、冻融裂解后再进行低速离心，合并2部分上清。有许多方法如冻融、高渗、超声、裂解 剂裂解可溶解细胞、释放禽流感病毒，但从规模化生产的方便和适用角度考虑，本发明采 取冻融、超声、裂解剂溶解细胞，以提高禽流感病毒产量。
[0043] 2、裂解剂
[0044] 按照本发明，几乎除培养工艺中没有使用裂解剂，选取药学、兽医学认为安全的表 面活性剂TritonX-100作为裂解剂，浓度为1-2% (v/v)。
[0045] 3、核酸酶
[0046] 许多核酸酶可以在实验室使用，如Benzonase、Pulmozyme或其他DNA酶、核酸酶， 但从兽医学、药学安全角度考虑，本发明选用Benzonase，其可通过断裂磷酸酯键而水解核 酸。使用浓度1-100单位/ml;
[0047] 4、深层过滤、微滤、超滤
[0048] 流感病毒收获病毒液经深层过滤（0. 65微米孔径）去除碎片，再经微滤（0. 45微 米孔径），切向流超滤（750KD)除去完整的MDCK细胞和大分子物质。灭活澄清液经膜孔截 留值为750, 000-1000, 000MWC0的切向流超滤膜超滤后，进入亲和层析柱，进一步除去MDCK 残余蛋白和残余DNA，经亲和层析病毒液通过超滤、除菌过滤、进入下一工艺步骤。
[0049] 5、亲和层析以及疏水反应层析
[0050] 按照发明，单一的层析或连续流超速离心或蔗糖密度梯度离心已经不能满足禽流 感标记疫苗的质量要求和标准，研究表明，中去除效果，亲和层析和疏水反应层析更适合对 大量禽流感病毒液中杂质DNA的处理。
[0051] 本发明在禽流感病毒纯化采用了一种亲和层析、在位核酸酶解、疏水反应层析的 组合，除去了大量的核酸，并浓缩了病毒原液。由于分子筛层析载量极限为柱体积的20%， 且分离效果依赖蛋白浓度，限制了分子筛层析在禽流感疫苗工业化生产的使用。本发明的 优点在于：（1)流速快30倍；（2)结合能力强；(3)收率高，（4)不需安装和清洁验证；（5) 做成滤芯，没有使用寿命和贮存安全的担忧；
[0052] 6、超滤、浓缩、透析
[0053] 禽流感病毒培养液、原液、纯化液至少需要透析，去除小分子杂质和化学物 质残余，也需要控制可操作体积，发明中提供了透析和超滤浓缩的步骤，使禽流感病 毒达到部分纯化和浓缩，发明中的超滤优先采用切向流的中空纤维柱，膜孔截留值为 750, 000-1000, 000MWC0,具有对禽流感病毒剪切小、病毒破损少的优点。
[0054] 用超滤透析和缓冲液交换除去生产过程中溶液中的糖、盐、非液体溶剂、低分子物 质，改变稳定禽流感病毒的粒子和pH环境，本发明在收获裂解后的工艺步骤中在纯化步 骤转接之前、疫苗配制之前都用超滤，调整缓冲液、调整体积，浓缩病毒液适合后续纯化的 载量要求。
[0055] 7、高度纯化
[0056] 细胞培养后流感病毒包括重组流感病毒去除杂质的纯化方法是经过低速离心、冻 融超声细胞沉淀、低速离心收的收获病毒液合并病毒液，再经深层过滤、超滤，亲和层析、在 位核酸酶解、疏水反应层析组合，连续流蔗糖密度梯度离心，增强了流感疫苗的安全性，扩 展了疫苗的适用种群和范围，特别是禽的特殊种群。
[0057] 首先，不含有害杂质，如宿主细胞MDCK蛋白、宿主细胞MDCK的DNA、不含动物源性 的活性物质，如酶或牛血清、工艺过程中的添加的化学物质残余。尽管目前暂未有国家标准 的细胞流感疫苗，特别是禽流感细胞培养疫苗标准或规程，但细胞性流感疫苗如MDCK细胞 流感疫苗制造过程必须说明、验证安全。本发明的标记疫苗工艺和质量标准说明了其安全 性。用传代的MDCK细胞制备流感