盒（CygnusTechnologies公司）按操作说明进行。牛血清白蛋白检测采用酶联 免疫法。
[0173] 工艺中的质量控制和检验结果见表1。标记抗原原液质量检验结果见表3。
[0174] 表3. 3批标记抗原半成品主要质量检验结果
[0175]
[0176] 每ml疫苗原液半成品中总蛋白总量20-72. 5μg/ml，禽流感病毒血凝素含量 5-7以8/1111，内毒素含量<1(^1]/1111，1?0(细胞蛋白残余量<1〇1^/1111、1?0(细胞0嫩残余 量< 100pg/ml、牛血清白蛋白残余量< 10ng/ml、甲醛残余< 50μg/ml、TritonX-100残余 彡15μg/ml、抗生素残余彡50μg/ml，禽流感M2蛋白残余彡2ng/ml。。
[0177] 实施例6禽流感病毒标记疫苗在10-20日龄鸡上的安全、效力以及诱导禽流感病 毒M2抗体的能力试验
[0178] 按照实施例1的方法制备四个批次的禽流感全病毒颗粒标记疫苗抗原，制备得 到的抗原用PBS(pH7. 6)稀释至5-7微克血凝素/lml，乳化需采用S印pic公司按佐剂 ISA780VG:抗原=70 :30(重量：重量）乳化。
[0179] 疫苗的安全性试验：每批疫苗取10-20日龄5只28dSPF鸡，分别在颈部皮下注 射疫苗样品lmL，在负压隔离饲养器中饲养观察14天观察临床体征，到期逐只进行剖检， 观察注射部位的病理变化。
[0180] 疫苗的效力试验：疫苗免疫后保护抗体试验，每批疫苗取10只10-20日龄SPF鸡， 分别在颈部皮下注射疫苗样品O.lmL，在负压隔离饲养器中饲养观察，分别于免疫后的前 28d每7d-次、28d以后每14d-次采免疫鸡心脏血样，按2000版农业部生物制品规程方 法检测HI抗体。
[0181] 免疫鸡的攻毒保护试验：每批疫苗取10只10-20日龄SPF鸡，分别在颈部皮下注 射疫苗样品〇.lmL，在负压隔离饲养器中饲养观察18d后，每只鸡用1000倍稀释的H5N2 病毒液攻毒lmL,同时取未免疫的同批SPF鸡10只使用相同剂量病毒攻毒作为阳性对照。 在负压隔离饲养器中饲养，观察疫苗的免疫保护效果。
[0182] 疫苗中蛋白抗体产生能力试验：以含3-7μg/ml血凝素的疫苗注射5周龄鸡和鸭 各10只，每次lml疫苗，免疫后7、21天分别再注射一次，最后一次免疫的一周后，米用专 利号为ZL201210241084. 9,发明名称为"一种制备甲型流感病毒全长M2蛋白的方法"的专 利申请所公开的方法制备和纯化M2抗原，然后用ELISA检测抗M2抗体。
[0183] 结果：免疫的鸡\鸭大剂量注射均没有检查到禽流感病毒M2蛋白抗体。因此根据 检测灵敏度和禽流感病毒疫苗纯度，禽流感标记疫苗最多含M2在l-2ng/ml之间，可作为标 记疫苗使用，对鸡和鸭反复三次注射免疫不产生抗体，可区别鸡、鸭的感染和免疫。禽流感 标记疫苗的安全、效力、诱导禽流感非结构蛋白抗体能力见表4。
[0184]
[0185] 实施例7.感染与免疫动物的区别（检测M2抗体以区别禽类感染和疫苗免疫）
[0186] 7. 1禽流感病毒全长M2蛋白的制备
[0187] 全长M2蛋白的制备方法，具体见专利ZL201210241084. 9.
[0188] 以全长M2蛋白为基础ELISA试剂盒的制备和验证，H5N1基因来源H5N1，基 因库(accessionnumberEU014132. 1)(http://www.ncbi.nlm.nih.rov/)，合成肽S M2e(2-24)氨基酸序列SLLTEVETPTRNEWECKCSDSSD，和合成肽M2e(2-18)氨基酸序列 SLLTEVETPTRNEWECKC，自行合成，用高压液相色测定纯度为85 %，溶于蒸馏水。
[0189] 7. 2免疫迎迹
[0190] 纯化的M2蛋白进行12. 5%SDS-PAGE电泳，电转染醋酸纤维素膜，转染后，用含 10%牛血清白蛋白PBST(0. 5%Tween20PBS)室温下封闭2h。待检测的血清见表1，用含 1 %BSA的PBST1:500稀释，加入室温孵育lh，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG孵 育，PBST洗涤，用（diaminobenzidine，DAB)作为底物，观察。
[0191]AIV参考血清禽流感各亚型参考血清购自中国农业部禽流感参比实验室，见表5， 所有血清来自SPF鸡接种AIV各亚型灭活疫苗，免疫2次，用血凝抑制试验测定免疫鸡抗 体。
[0192] 表5.禽流感病毒抗血清参考品
[0193]
[0194]
[0195] 7. 3重组M2蛋白ELISA优化
[0196]M2的检测使用浓度、AIV阳性和阴性血清的光密度0D450nm值的确定：
[0197]M2蛋白用0. 1M碳酸钠缓冲液（pH9. 6)稀释至0. 82-200mg/mL，包被96孔平底 板，室温孵育过夜，用高盐洗液（WB，NaCl，37. 5g，KC1，0· 2g，Na2HP04, 1. 15g，KH2P04, 0· 5g， Tween20, 0· 5ml溶于1L蒸馏水，，pH7. 2)洗涤，用含5%BSA的PBS室温封闭未饱和的 孔（200微升/孔），室温孵育2h，用WB洗涤三次.待检血清用稀释液（DB) (0. 1MTrispH 7· 4, 0· 5MNaCl，lmMNa2EDTA，2%w/vBSA，3%w/vTritonX-100, 3%w/vTween20)按 1 ; 25-1 :800稀释血清，每孔100微升，复孔加入，室温孵育lh，所有的检测试验设有阳性血清 和阴性血清对照各4孔。用PBS-T洗涤三次，每孔加入辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgG100 微升，室温孵育lh，洗涤后加入底物溶液（100mg/mlTMB，溶于柠檬酸溶液pH8)，每孔加入 100微升0. 6%H202,孵育10-15min，颜色反应用1M硫酸终止，测定0D450。
[0198] 7. 4 合成肽M2eELISA优化
[0199] 合成肽M2e_23、M2e_18合成肽作为包被抗原进行ELISA反应，合成肽M2e_23、 M2e-18合成肽lmg溶于lmL无菌蒸馏水，0. 1M碳酸钠缓冲液（pH9. 6)倍比稀释至含 160-0. 31mg/mL，包被96孔板，其余步骤和重组M2蛋白ELISA优化相同。
[0200] 重组M2蛋白ELISA、合成肽M2eELISA优化，每份血清样本用4孔，2孔用抗原包 被，2孔不包被用作每个血清标本的内部对照。每份血清，抗原阴性孔的平均0D450为抗原 包被血清孔0D450和"正确0D450值"的差。正确0D450值大于阴性血清平均正确0D450+2 倍标准差（临界值）时，血清阳性。
[0201] 7. 5AIV感染试验：重组M2为基础的ELISA和通常HA为基础的血凝抑制试（HI) 验进行DIVA试验比较
[0202] 试验的目的是模仿和测定重组重组M2为基础的ELISA在检测免疫鸡受活病毒感 染时的灵敏度，和HI法比较的检测效率。试验性免疫/攻击的鸡血清来自山西隆克尔生物 制药公司，是用21天龄、未免疫无AIV感染的20只肉鸡制备。鸡分成2组，每组20只，第 一组单剂灭活纯化禽流感疫苗（实施例1制备）。第二组不免疫单独相同条件饲养。第一 组免疫三周后用同源HA抗原采用HI法测定血凝抑制抗体。移入在P3实验房的隔离器中 用 106ELD50AIV(A/Ck/WestJava/Pwt-Wij/2006)病毒液 0.lml经鼻内感染。第二组继续 饲养不免疫也不攻毒。攻毒2周后，2组所有的鸡取血单独进行HI抗体检测和M2ELISA检 测，比较监测免疫鸡感染和免疫的效率，同时用t检验的方法比较M2ELISA和HI检验鸡的 感染攻击。
[0203] 7. 6重组M2ELISA大规模DIVA检测
[0204] 本实例评估重组M2ELISA田间使用的效果。检测了 3组鸡，包括（a)阴性组（非感 染和非免疫组，收集了商用肉鸡和蛋鸡群的血清，用IDEXXAIV抗体检测试剂盒确证无AIV抗体；(b)免疫组，总计334份血清，来自河北威县养鸡场；（c)感染组（c)总计56份血清， 来自河北威县养鸡场；用M2-ELISA测定每份血清正确0D值（450nm)并比较不同检测组的 数值，用Tukey检验平均值的差异，考量M2-ELISA区别免疫鸡和非免疫鸡血清的能力。
[0205] 7. 7ELISA临界值
[0206] 使用双平面接收操作特征（two-graphreceiveroperatingcharacteristic， TG-ROC)分析，从H5N1感染鸡血清（标准血清以及试验性感染攻击血清）、疫苗免疫鸡的血 清的ELISA检测值测算。所有的动物实验均在中国流感中心P3试验房符合生物安全3级 要求下进行，试验用鸡按国家试验动物指导原则饲养，试验结束后C02麻醉，心脏穿刺取。
[0207]结果：
[0208] 1、免疫印迹确证重组M2蛋白
[0209] 纯化的重组M2蛋白用AIV血清包括活的H5N1 (A/Chicken/Scotland/1959和A/ Ck/VietNam/8/2004) ^H5N2(A/0strich/Denmark/72420/1996) ^liveH9N2 (A/Turkey/ Wisconsin/1/1966,均有舒跃龙博士惠赠，进行免疫印迹，H5N1、H5N2、H9N9抗血清与 15-18kD的蛋白反应。免疫H5N1 (疫苗）的抗血清因无抗M2抗体，则无显示反应的条带。
[0210] 2、重组M2ELISA和合成的M2eELISA优化
[0211] 免疫印迹确证了M2蛋白的抗原性并能从免疫的鸡血清区别活的病毒感染，有可 能用此抗原的ELISA评估，另外一方面，合成肽M2e-18ELISA也可区别感染和免疫的鸡。首 先，对M2的包被抗原和活H5N1血清的最低背景的最大吸收值为25μg/ml，M2e-18肽为 10μg/ml，结果见表6、表7及图3、图4，H5N1活的和灭活抗血清在1 : 100稀释时，非特异 性反应最小，获得最高0D450值。因此后续ELISA检测，血清稀释按此稀释度。
[0212] 表6重组全长M2蛋白ELISA包被浓度优化
[0213]
[0214] 表7Me2_18合成肽ELISA包被浓度优化
[0215]
[0216] 3、重组M2ELISA和合成的M2eELISA检测活AIV暴露的比较
[0217] 重组M2ELISA和合成的M2eELISA检测AIV11中亚型鸡免疫血清（HI滴度在 6-91og2)，结果表明，使用2种ELISA方法对所有免疫血清检测存在相当程度的一致。但 对H3N2抗血清，M2蛋白的反应性低于M2e合成肽，可能产生了某种干扰。
[0218] 表8及图5显示2种活H5N1株，苏格兰和越南株的抗血清和重组M2蛋白反应 强烈，和灭活疫苗免疫血清没有反应。清楚说明了M2蛋白在DIVA检测从感染动物区别 免疫的可操作性。M2蛋白和M2e合成肽ELISA检测结果显著呈正向Pearson相关（p= 0. 05, 67% )，显示用M2蛋白代替昂贵M2e合成肽的可能。
[0219] 表8重组全长M2蛋白ELISA检测参考血清
[0220]
[0221]
[0222] 活的AIV亚型的抗血清HI1N6、H7N7、H1N1、H7N1、H2N3、H9N2、H3N8、H5N2 用ELISA 检测都和M2、M2e合成肽反应，这也和M2蛋白的广谱抗原性一致。
[0223] 4、重组全长M2蛋白ELISA检测AIV具有高度的灵敏性，优于常规HA为基础的HI 滴度检测
[0224]HI、重组M2ELISA对免疫鸡感染AIV监测，HI滴度不能区别已经免疫鸡的活病毒 感染（A/Ck/WestJava/Pwt-Wij/2006)，结果如图6，ELISA检测免疫鸡和非免疫鸡血清，感 染前0D值几乎相等，感染后0D值从0. 14急剧上升到1. 2,达到8倍增高，结果如图7所示。 M2ELISA临界值为0. 58,T检验统计分析确证M2ELISA对活病毒的感染区别的高效，优于普 通常规的HA法（p= 0· 00001)。
[0225] 5、M2和M2e合成肽ELISA检测田间样品（大规模DIVA检测）
[0226]M2和M2e合成肽ELISA检测非免疫、免疫的商用蛋鸡血清、非免疫肉鸡血清。
[0227] 非免疫蛋鸡中，除M2ELISA检测有6份血清0D450大于0. 58,为阳性，假阳性率为 2. 9%，其余皆为阴性，对假阳性血清进行免疫印迹分析显示没有和M2蛋白反应。免疫鸡群 的血清中，M2ELISA检测，有19/334份血清阳性，假阳性率为5. 6%，表明M2ELISA区别田间 非感染鸡群（阴性）和免疫鸡群的高效性感染鸡群和非感染鸡群、免疫鸡群的ELISA0D值 显著差异。见表9及表10。
[0228] 表9.重组全长Μ蛋白ELISA检测感染血清、阴性血清、免疫血清抗体比较
[0229]
[0231](p= 0.0001)。
[0232] 表10.重组全长M2蛋白ELISA检测田间大量临床样本血清结果
[0233]
[0234] 6、以全长