O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程学和免疫学技术领域，具体涉及一种O型口蹄疫病毒样颗粒 疫苗及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 口 蹄疫是（Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的急性热性高度接触性传染病，以传染性强、传播速度快、危害 严重而著称。FMD的宿主范围很广，包括家养的反刍动物、鹿和猪以及70多种野生的偶蹄动 物均可感染，世界动物卫生组织（OIE)将其列为A类传染病之首。口蹄疫一旦爆发往往造 成大流行，不易控制和消灭，给疾病流行国家和地区的畜牧业带来严重的经济损失。目前世 界各国对于口蹄疫的防治采取扑灭根除、免疫控制和预防三种策略。大多数发展中国家采 取的方式是免疫控制。传统的灭活疫苗在口蹄疫的防治中发挥着主导作用，但灭活疫苗只 能激发机体体液免疫、虽然市场广泛使用，但实际应用过程中效果不理想。因此，研制更为 安全、有效的新型FMD疫苗显得尤为重要。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个主型A、0、 C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型，以及65个以上亚型。0型口蹄疫为全世界流行最广的 一个血清型。
[0003] 近年来病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs)在疫苗和呈递系统方面的应用 受到广泛关注。VLPs具有免疫性强，能激发体液免疫，细胞免疫和粘膜免疫，具有安全、高效 的特点，是很有发展前景的候选疫苗或载体。对于多种疾病来说都是一种可开发理想的疫 苗形式。已经有乙型肝炎病毒（HBV)、HEV和人类乳头瘤病毒（HPV) VLP疫苗上市。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有灭活口蹄疫疫苗存在的安全性差、使用效果不理想的问题，本发明 提供一种能够有效预防口蹄疫病毒且安全有效的0型口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方 法和应用。
[0005] 本发明提供的一种0型口蹄疫病毒样颗粒疫苗，该疫苗的氨基酸序列如序列表中 的SEQ ID NO: 1所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0:2所示。
[0006] 进一步的，所述氨基酸序列即序列表中的SEQ ID NO: 1包含0型口蹄疫病毒VPl 蛋白上的全部抗原决定簇序列。
[0007] 进一步的，所述核苷酸序列即序列表中的SEQ ID NO:2包含0型口蹄疫病毒VPl 基因上的全部抗原决定簇基因序列。
[0008] 进一步的，所述核苷酸序列是通过将含有0型口蹄疫病毒VPl基因的完整开放阅 读框利用XhoI和Sail酶切位点插入到核表达载体pET30a的多克隆酶切位点上获得的。
[0009] 本发明还提供一种重组表达载体质粒PET30-FMD-VP1，该载体含有两个his标 签和0型口蹄疫病毒VPl基因的完整开放阅读框，能将序列表中的SEQ ID NO: 1所示的 氨基酸序列翻译成序列表中的SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；该重组表达载体质粒 PET30-FMD-VP1经转化后形成一种用于蛋白表达的宿主细菌。
[0010] 本发明提供的一种O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗的制备方法，该方法通过以下步骤 实现：
[0011] 1)采用PCR扩增方法构建O型口蹄疫病毒抗原VPl基因，得到带有XhoI和Sail 酶切位点的〇型口蹄疫病毒抗原VPl基因片段，该VPl基因片段的核苷酸序列如序列表中 的序列2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的序列1所示；
[0012] 2)将含有0型口蹄疫病毒VPl基因的完整阅读框利用XhoI和Sail酶切位点， 插入到原核表达载体pET30a多克隆酶切位点上，经测序正确后得到重组表达载体质粒 PET30-FMD-VP1，该重组表达载体质粒上含有序列表中的SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；
[0013] 3)将步骤2)中的重组表达载体质粒pET30-FMD-VPl转化大肠杆菌BL21 (DE3)中 获得重组基因工程菌，利用LB液体培养基振荡培养至0D600 = 0. 6,通过添加 ITPG至终浓 度为lmmol/L诱导重组基因工程菌表达并自主包装成病毒样颗粒结构，诱导条件为：温度 37°C，转速 180r/min，诱导 6h ;
[0014] 4)离心收集诱导后的菌体细胞，反复冻融3次，加入1/10菌液体积的PBS缓冲液 重悬菌体，超声波破碎菌体，15000r/min离心15min，取上清液，经过镍柱纯化后得到0型口 蹄疫病毒样颗粒疫苗。
[0015] 进一步的，步骤1)采用PCR扩增方法构建0型口蹄疫病毒抗原VPl基因：首先合 成上下游引物，引物序列如下：
[0016] 上游引物：5' -GGGTCGACATGACCACTTCGACGGGCGAGTCGGCTG-3'，
[0017] 下游引物：5, -CCCTCGAGCAAGGACTGCTTTACAGGCGCCACT-3' ；
[0018] PCR扩增出的特异性片段，通过1%琼脂糖凝胶电泳后回收，得到带有XhoI和Sail 酶切位点的〇型口蹄疫病毒抗原VPl基因片段，该VPl基因的核苷酸序列中，两侧Xhol和 Sail酶切位点均含一个碱基的突变。
[0019] 进一步的，步骤4)中，所述镍柱纯化的具体过程如下：
[0020] 将上清液加入到平衡好的镍糖中，室温在摇床孵育2h，500r/min离心2min后弃上 清，用洗脱液洗5次，除去杂质和残留的培养基，用250ml洗脱液进行蛋白镍柱分离洗脱，先 加入200 μ 1洗脱液，孵育2min，然后用收I. 5ml管收集，重复收集3~5次，得到0型口蹄 疫病毒样颗粒疫苗。
[0021] 进一步的，还包括步骤5)电镜观察：取10 μ L纯化的0型口蹄疫病毒样颗粒疫苗 样品，加在铜网的碳膜上，经2%的磷钨酸染色5min，室温干燥2h，磷钨酸染色是负染，背景 为黑色，病毒样颗粒为白色，呈病毒样形态。
[0022] 本发明提供的一种0型口蹄疫病毒样颗粒疫苗在动物免疫中的应用，将所述0型 口蹄疫病毒样颗粒疫苗与弗氏佐剂混合后通过肌肉注射方法对动物进行免疫，能够诱导动 物产生0型口蹄疫病毒的特异性抗体，所述0型口蹄疫病毒样颗粒疫苗的用量为100 μ g/ 只。
[0023] 本发明所述疫苗的结构是以病毒样颗粒形式存在，口蹄疫病毒VPl表位在病毒样 颗粒的表面，本发明提供了构成病毒样颗粒疫苗的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷 酸序列，且所述的核苷酸序列含有能够在表达中自我组装成病毒样颗粒的外壳蛋白全部基 因。
[0024] 本发明的有益效果是：
[0025] 1)本发明提供的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗，免疫后可诱导动物同时产生抗O型 口蹄疫的抗体。
[0026] 2)本发明提供的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗制备安全性好，无病毒返强、散毒的 可能性。
[0027] 3)本发明提供的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗为病毒样颗粒结构，O型口蹄疫病毒 的抗原表位被有效呈递在类病毒颗粒的表面，病毒样颗粒有感染性，但无病毒核酸，不能再 体内复制，但可以很好地刺激B、T细胞，引起细胞免疫和体液免疫，引发机体发生免疫应 答。
[0028] 4)病毒样颗粒疫苗因其以病毒粒子样结构存在，在体内半衰期长，抗原性好，稳定 性好，可刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫有效期长，且疫苗运输储存方便、有利于 推广使用。
[0029] 5)该病毒粒子表达系统为大肠杆菌工程菌，表达量大且易于控制，表达的蛋白小， 在上清中，利于纯化和大规模制备。
[0030] 6)本发明利用大肠杆菌pET30a表达系统，表达含有口蹄疫病毒（FMD)O型VPl蛋 白，可在表达上清中形成病毒样颗粒（VLPs)，免疫印迹试验试验表明，表达的病毒样颗粒蛋 白能够与标准O型口蹄疫病毒阳性血清特异结合，具有良好的免疫学活性，为口蹄疫病毒 感染快速特异诊断试剂研制和颗粒样疫苗研制奠定了基础。
[0031] 7)本发明提供的一种重组表达载体质粒pET30a-FMD-VPl含有两个his标 签和O型口蹄疫病毒VPl基因的完整开放阅读框，能将序列表中的SEQ ID NO: 1所示 的氨基酸序列翻译成序列表中的SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；该重组表达载体 质粒PET30-FMD-VP1经转化后形成一种用于蛋白表达的宿主细菌，重组表达载体质粒 pET30a-FMD-VP 1在应用时安全稳定，可广泛用于蛋白表达。
【附图说明】
[0032] 图1为VPl基因的PCR扩增结果图。图中：M :DNA分子质量标准；I :VP1的PCR产 物。
[0033] 图2为0型口蹄疫病毒抗原VPl基因片段与原核表达载体pET30a的连接产物的 Sall/Xholl双酶切鉴定结果图。图中：M:DNA分子质量标准；I :SalI/XholI双酶切产物； 2 :阳性对照。
[0034] 图3为重组表达载体质粒pET30-FMD-VPl表达产物的SDS-PAGE电泳检测图。图 中：M :蛋白质分子质量标准；1 :未诱导的表达产物；2 :未诱导的空菌体；3 :诱导Ih的表达 产物；4 :诱导Ih的空菌体；5 :诱导3h的表达产物；6 :诱导3h的空菌体；7 :诱导6h的表达 产物；8 :诱导6h的空菌体。
[0035] 图4为重组表达载体质粒pET30-FMD-VPl表达产物的Western-blot检测图。图 中：M :蛋白质分子质量标准；1 :阳性血清；2 :阴性血清。
[0036] 图5为重组表达载体质粒pET30-FMD-VPl所表达的VPl蛋白形成病毒样颗粒的电 镜图。
[0037] 图6为小鼠抗血清效价ELISA检测图。
【具体实施方式】
[0038] 实施例1 :0型口蹄疫病毒抗原VPl基因的获得
[0039] 采用PCR扩增方法构建O型口蹄疫病毒抗原VPl基因。首先合成上下游引物，弓丨 物序列如下：
[0040] 上游引物：5' -GGGTCGACATGACCACTTCGACGGGCGAGTCGGCTG-3' ；
[0041] 下游引物：5，-CCCTCGAGCAAGGACTGCTTTACAGGCGCCACT-3 '。
[0042] 上述的上下游引物序列中，下划线部分为与VPl基因互补序列，加粗斜体部分为 引入的XhoI和Sail酶切位点。PCR扩增出的特异性片段，通过1%琼脂糖凝胶电泳后回收， 得到带有XhoI和Sail酶切位点的0型口蹄疫病毒抗原VPl基因片段，该VPl基因片段的 核苷酸序列如序列表中的序列2所示（VP1基因的核苷酸序列，两侧Xho