一种确定口蹄疫疫苗组份及估计抗原含量的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种确定口蹄疫疫苗组份及估计抗原含量的方法。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫(foot and mouth disease, FMD)是猪、牛、羊等主要家畜和其它偶蹄动物 共患的一种急性、高度接触性传染病。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。 该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。世界动 物卫生组织(0ΙΕ)将其列为必须申报的传染病，我国也将其列为一类动物传染病之首。
[0003] 口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)属于微核糖核酸病毒科口 蹄疫病毒属，有七个血清型:〇型、A型、亚洲I型、C型以及南非1、2、3型。各血清型之间没有交 叉保护。现阶段我国主要流行〇型、A型和亚洲I型。
[0004] 计划免疫是预防、控制口蹄疫的有效手段之一。目前，口蹄疫灭活疫苗使用最为广 泛;为确保它安全有效，应对其质量进行严格的控制。口蹄疫疫苗效力检测的"黄金方法"是 本动物攻毒保护试验，或采用PD 5Q测定法(欧洲）：即用疫苗50%动物保护剂量(PD5Q)来评价 疫苗免疫效果，常规疫苗需至少达到3个ro 5〇,紧急接种疫苗需至少达到6个ro5〇 (根据疫苗 使用情况，我国已提高此标准，要求常规疫苗达到6个ro5Q);或采用(PGP)测定法(南美）：即 用疫苗保护百分率(PGP)来评价疫苗免疫效果，PGP达到75%以上，该疫苗合格。试验用动物 必须是来自无口蹄疫地区、无口蹄疫病毒中和抗体的非疫苗免疫本动物。由于我国采取强 制免疫手段控制口蹄疫，所以筛选合格的试验动物相当困难;另外，这种方法的成本高、周 期长、重复性较差，且需要高安全动物舍，不易操作。
[0005] 众所周知，疫苗是由抗原与佐剂以一定比例、按特定程序乳化而成的，因此，决定 其免疫效果的两个关键因素是"抗原"与"佐剂"。"抗原"不同，疫苗就不同，筛选到好的"抗 原"，其诱导的免疫保护力强，疫苗的免疫效果就好。当然"佐剂"不同，疫苗也不同。好的"佐 剂"可以激发广谱的免疫反应，与"抗原"诱导的免疫反应不同，"佐剂"诱导的是非特异性 的；"抗原"诱导的是特异性的，即针对某个型别的口蹄疫。对于疫苗生产商而言，希望"抗 原"与"佐剂"都好，强强联合，生产出优质的疫苗。
[0006] 现在国家对于口蹄疫疫苗生产企业均按兽药GMP(生产质量管理规范)进行认证。 按此标准，要求企业从原料、人员、设施设备、生产过程、包装运输、质量控制等方面达到国 家法规规定的卫生质量要求，具备良好的生产设备，合理的生产过程，完善的质量管理和严 格的检测系统，确保疫苗质量符合法规要求。在此条件下，应用的"抗原"（种毒)与"佐剂"是 特定的，而有所变动的是各批次间的"抗原含量"，它受细胞培养方式(贴壁或悬浮)及细胞 生长状态、培养液的pH值、病毒的复制情况、病毒收获时间、灭活的温度及时间等诸多因素 影响，会有一定的变化。鉴于我国已提高口蹄疫常规疫苗的标准（至少含6个PD50)，而常规 生产的抗原含杂蛋白多(如细胞碎片）、有效抗原含量较低，可能达不到这个要求，生产企业 会对初始获得的抗原进行纯化和浓缩。而生产工艺越复杂，其批次间抗原含量可能出现波 动性的机率就越大。需要我们加强监测，剔除不合格的批次。
[0007] 口蹄疫血清学效力检测是通过检测疫苗免疫后的抗体滴度水平来评价疫苗免疫 效力，它可以综合评价免疫抗原及佐剂的效果。主要包括病毒中和试验(Stellman等1968; Pay等1976)和液相阻断ELISA试验（马军武等2006)。1968年，Stellman等提出了用中和抗 体滴度分析疫苗效力的统计学方法;到1976年，Pay等根据中和抗体滴度和疫苗效力的关系 建立了疫苗的抗原剂量、中和抗体滴度和保护率的相关公式。马军武等通过液相阻断ELISA 检测疫苗免疫抗体与攻毒保护分析确定了牛、羊、猪等口蹄疫免疫抗体与攻毒保护的关系。 疫苗免疫血清抗体效价检测须用非口蹄疫疫苗免疫动物，无法从根本上取代本动物的使 用，动物的选择仍存在困难。而且这两种方法是"事后评价"，不能在疫苗使用前对疫苗的质 量加以评估，剔除不合格的产品。并且这两种方法对试验室的要求高，病毒中和试验必须在 高安全实验室进行，防止病毒外散;ELISA必须有恒温培养箱、酶标仪等，不适合基层应用。
【发明内容】
[0008] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种确定口蹄疫疫苗组份及估计 抗原含量的方法，本发明方法从根本上取代了时疫苗免疫血清抗体效价检测本动物的使 用，使得动物的选择变得容易，而且在疫苗使用前就能对疫苗的质量加以评估，剔除不合格 的产品。
[0009] 本发明先对口蹄疫疫苗破乳，获得抗原，并对其进行浓缩，之后根据它与检测血清 (纯化的146S抗原制备）的免疫扩散试验所出现沉淀线情况判定疫苗的组份(即是亚洲1型 单价疫苗、〇型单价疫苗、或是0+A双价疫苗、还是0+亚+A型三价疫苗)及抗原含量的方法。本 发明操作简单、特异性强、稳定性好、非常适合于基层应用。
[0010] 本发明提供一种确定口蹄疫疫苗组份的方法，步骤如下： (1) 对待测口蹄疫疫苗破乳，分离出抗原相； (2) 对分离出的抗原相进行浓缩； (3) 用纯化后的口蹄疫病毒亚洲1型、0型、A型三个型别的146S抗原分别免疫动物，制 备亚洲1型、0型、A型三个型别的检测血清； (4) 将浓缩抗原分别与亚洲1型、0型、A型三个型别的检测血清进行免疫扩散试验； (5) 根据沉淀线情况判定待测口蹄疫疫苗组份：出现沉淀线则证明待测口蹄疫疫苗中 含有相应口蹄疫病毒146A抗原；反之，则证明待测口蹄疫疫苗中没有相应口蹄疫病毒146A 抗原。
[0011 ]作为优选，步骤（1)中所述对待测口蹄疫疫苗破乳是将待测口蹄疫灭活疫苗加入 外筒中加有冰水混合物的油佐剂疫苗破乳器中进行破乳。
[0012] 作为优选，在用口蹄疫病毒灭活抗原免疫动物前需要经过纯化(获得146S抗原）， 在此过程中需要使用研磨重悬装置对口蹄疫病毒抗原的离心沉淀物进行研磨重悬。
[0013] 本发明还提供一种确定口蹄疫疫苗估计抗原含量的方法，步骤如下： (1) 对待测口蹄疫疫苗破乳，分离出抗原相； (2) 对分离出的抗原相进行浓缩； (3) 用纯化后的口蹄疫病毒亚洲1型、0型、A型三个型别的146S抗原分别免疫动物，制 备亚洲1型、0型、A型三个型别的检测血清； (4) 将浓缩抗原以不同倍数稀释，分别与亚洲1型、0型、A型三个型别的检测血清进行免 疫扩散试验； (5)根据出现沉淀线的最高抗原稀释倍数估算待测口蹄疫疫苗中抗原含量，计算公式： 含量=(出现沉淀线的最高稀释倍数Xl〇yg/mL +浓缩倍数）X [抗原相体积/(抗原相+油 相)的体积]。
[0014] 作为优选，步骤（1)中所述对待测口蹄疫疫苗破乳是将待测口蹄疫灭活疫苗加入 外筒中加有冰水混合物的油佐剂疫苗破乳器中进行破乳。
[0015] 作为优选，在用口蹄疫病毒灭活抗原免疫动物前需要经过纯化(获得146S抗原）， 在此过程中需要使用研磨重悬装置对口蹄疫病毒抗原的离心沉淀物进行研磨重悬。
[0016] 以下对本发明的方法进行详细的描述。
[0017] 本发明的一种确定口蹄疫疫苗组份及估计抗原含量的方法包括以下步骤： 步骤一，口蹄疫疫苗破乳及抗原的分离:将口蹄疫灭活疫苗加入外筒中加有冰水混合 物的油佐剂疫苗破乳器(新型专利号：201520326388.4)中，按5: