Ehd2抗体在制备卵巢癌免疫组化检测试剂中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种EHD2抗体在制备卵巢癌免疫组化检测试 剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是严重危害人类生命和健康的常见病和多发病，是导致残疾和早死的主 要疾病之一，在35~59岁年龄组中，恶性肿瘤居死因第一位。资料显示，我国恶性肿瘤年发 病例数为200万，死亡约150万，并以3%的速度递增且呈年轻化趋势，居各类疾病中死亡率 之最。
[0003] 卵巢癌是卵巢肿瘤的一种恶性肿瘤，是指生长在卵巢上的恶性肿瘤，其中90%~ 95 %为卵巢原发性的癌，另外5 %~10 %为其它部位原发的癌转移到卵巢。卵巢癌的发病率 低于宫颈癌和子宫内膜癌居妇科恶性肿瘤的第三位，但死亡率却超过宫颈癌及子宫内膜癌 之和，高居妇科癌症首位，是严重威胁妇女健康的最大疾患。尽管化疗在恶性肿瘤的治疗中 占有非常重要的地位，但是在临床实践中，结果往往不尽如人意。目前，包括卵巢癌在内的 肿瘤异质性问题得到广泛重视，即使在临床表现上或传统病理分型上类同的肿瘤，其发病 的分子根源也不尽相同，这就要求从分子病理水平更深入地探究肿瘤，提高诊疗的精准度。 目前，利用免疫组织化学方法对关键肿瘤相关蛋白进行组织学检测是关系到肿瘤精准诊疗 的重要环节。
[0004] 免疫组织化学技术应用免疫学抗原抗体反应基本原理，通过抗体对体内蛋白质分 子抗原的特异性识别，以及化学标记(荧光素、酶、金属离子、同位素等）的第二抗体的显色 等作用来检测组织细胞内目标抗原（多肽和蛋白质）的表达量及其亚细胞定位。近年来，随 着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的成功研发，更主要的是对肿瘤分子机制认 识的不断深入，免疫组化在肿瘤的分子诊断与鉴别中的应用价值受到了普遍的认可。
[0005] 本申请前期研究发现EHD2蛋白的表达水平与卵巢癌的恶性程度相关，自主研发的 EHD2特异抗体可用于卵巢癌的免疫组化检测。EHD2(Epsin homology (EH)-domain-containing protein 2) 是 EHD 蛋白的一种，是一类新型膜转运调控蛋白 ，含有高度保守的 EH结构域。参与受体内吞等胞膜转运的多步调控，是整个胞膜转运机制的必不可少的重要 环节，在多种细胞中起分子与物质运输及信号传导等关键作用，它的失调将导致细胞信号 应答失当及细胞功能紊乱，并可能进而引发疾病。因此对EHD2进行免疫组化检测将更客观 准确地反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床特性。目前，由EHD2特异抗体制备的免疫组 化试剂未见报道，EHD2抗体在制备卵巢癌免疫组化检测试剂中的应用也没有先例。
[0006] 为解决上述问题，本发明公开了一种EHD2特异抗体在制备卵巢癌免疫组化检测试 剂中的应用。
[0007] 虽然现有的商业化EHD2抗体有十余种，由主流抗体试剂公司Santa Cruz和Abeam 等提供，但是均属于基础研究用试剂，没有依据表明这些抗体可以和我们的抗体一样具有 合格的特异性并可用于卵巢癌免疫组化检测，特别是目前尚没有任何其它EHD2抗体经过大 量组织标本的免疫组化验证并显示出可以通过对EHD2的组织细胞表达水平进行检测来达 到对卵巢癌恶性度及患者生存情况进行预后预判的目的。与本专利申请抗体相比它们有如 下缺陷：
[0008] 1、根据本领域公知常识，能够用于免疫组化（IHC)的抗体会在其使用说明中作出 明确标识和注明，按这些抗体的说明所示，大多数都不能用于免疫组化（IHC)检测。虽然个 别抗体标明可用于免疫组化(IHC)，但仔细研究发现并非如此。一个是南京森贝伽公司代理 的EHD2抗体，但是注明了只能检测膜定位。另一个是Proteintech公司的货号为11440-1-AP 的抗体，然而此抗体的特异性存在问题:首先免疫印迹检测得到的主要信号位置明显小于 60kD，而70kD的正常位置信号却很弱，说明虽然可以检测到EHD2,但更多检测到的是其它未 知分子;其次从公司发表的该抗体对卵巢癌组织的免疫组化图中可见染色信号为明显的基 质成分的非特异性着色。
[0009] 2、这些抗体均为研究用试剂，没有经过大样本临床病例试验或验证，没有关键的 对EHD2的细胞定位检测能力。
[0010] 3、均没有经过严格的免疫印迹特异性验证，特别是与EHD2蛋白的同源蛋白EHD1、 EHD3、EHD4的交叉反应的免疫印迹实验验证，而这些验证对EHD2的免疫组化检测方法来说 尤其重要，因为它们之间具有很高的同源性(>70%)。中国文献"EHD2下调促进乳腺上皮细 胞转化的研究"（田刚等，现代医学检验杂志，2012年第27卷第1期，49-51)公开了一种由其 自制的EHD2抗体，这一抗体是采用我们的没有经过抗原纯化的抗体，可以用于免疫印迹检 测，但不能满足免疫组化检测的高度特异性要求。
[0011]本申请前期研究发现EHD2蛋白的表达与定位在卵巢癌中产生异变，自主研发的 EHD2特异抗体可用于卵巢癌的免疫组化检测。EHD2(Epsin homology (EH)-domain-containing protein 2) 是 EHD 蛋白的一种，是一类新型膜转运调控蛋白 ，含有高度保守的 EH结构域。参与受体内吞等胞膜转运的多步调控，是整个胞膜转运机制的必不可少的重要 环节，在多种细胞中起分子与物质运输及信号传导等关键作用，它的失调将导致细胞信号 应答失当及细胞功能紊乱，并可能进而引发疾病。因此对EHD2进行免疫组化检测将更客观 准确地反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床特性。目前，由EHD2特异抗体制备的免疫组 化试剂未见报道，EHD2抗体在制备卵巢癌免疫组化检测试剂中的应用也没有先例。
[0012] 为解决上述问题，本发明公开了一种EHD2特异抗体在制备卵巢癌免疫组化检测试 剂中的应用。
【发明内容】
[0013] 为解决【背景技术】中提到的目前在临床上对肿瘤的判别主要还是基于在组织病理 水平对肿瘤组织和肿瘤细胞进行常规形态学观察，受病理医师经验等人为因素影响较大， 缺乏更深层次的与病人个体发病因素相关的分子依据的问题，本发明公布了 EHD2特异抗体 在制备卵巢癌免疫组化检测试剂中的应用。
[0014] 本发明解决的技术问题通过以下技术方案来实现：
[0015] EHD2抗体在制备卵巢癌免疫组化检测试剂中的应用，其特征在于，包括EHD2特异 抗体的制备和卵巢癌免疫组化检测试剂的制备。
[0016]所述EHD2特异抗体的制备，包括：
[0017] 基因 EHD2的GeneBank国际通用序列编号为:NM_014601，所述基因 EHD2编码蛋白的 GeneBank国际通用序列编号为:NP_055416〇
[0018] 所述EHD2特异抗体是一种对人EHD2蛋白特异的抗体，所述抗体能特异性识别人 EHD2蛋白，所述识别位点的氨基酸序列为:503-SEQ ID N0:l-543。
[0019] 一种多肽，其氨基酸序列为SEQ ID N0:1，以所述多肽氨基酸序列为核心序列对其 进行修饰，所述修饰为在多肽N端连接一个半胱氨酸;修饰后的所述多肽经纯化后作为抗原 对动物进行免疫以制备EHD2抗体并进行抗原纯化。
[0020] 所述卵巢癌免疫组化检测试剂的制备，包括：
[0021] 卵巢癌免疫组化检测试剂，用于对卵巢癌组织中EHD2的表达水平和定位进行检 测，是采用前述对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体。
[0022]有益效果
[0023]本发明公开了 EHD2抗体在制备卵巢癌免疫组化检测试剂中的应用，由于EHD2蛋白 参与受体与胞膜转运的多步调控，以及在各种细胞中对维持物质运输与信号传导等起关键 作用，与肿瘤等疾病的发生密切相关。因此对EHD2进行免疫组化检测将更客观准确地从分 子水平反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床特点，符合肿瘤的精准医疗原则和趋势。 [0024]本发明公开的EHD2抗体在制备卵巢癌免疫组化检测试剂中的应用，以对人EHD2蛋 白特异的抗体作为一抗或核心抗体，制备卵巢癌免疫组化检测试剂，制备出的试剂特异性 好，灵敏度高，显色性好。
【附图说明】
[0025]图1是免疫印迹图；
[0026]图2是EHD3浆中弱表达下的卵巢癌组织200倍镜下免疫组化图；
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