用于转移性肾细胞癌鉴别诊断的双标免疫组化染色试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及免疫组织化学染色的【技术领域】，尤其是涉及一种用于转移性肾细胞癌鉴别诊断的双标免疫组化染色试剂盒，该试剂盒中包括DAB显色液、由PAX8抗体和CD10抗体的混合液混合形成的一抗或/和HRP酶标的二抗。为了克服转移性肾细胞癌组织学特征极易与肾上腺肿瘤、肺癌、肝癌、甲状腺癌等相混淆，不易确诊，常规免疫组化方法分别检测耗时费力，且穿刺活检标本组织量不够等不足，利用该方法保持了混合性抗体中各个抗体通单染时同样的敏感性和特异性外，还具有染色步骤少，实验时间短、稳定性高、实验结果直观对比，所带来的信息量远比传统单染高等优点，尤其对于标本量少的活检病理诊断具有显著优势。
【专利说明】用于转移性肾细胞癌鉴别诊断的双标免疫组化染色试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫组织化学染色的【技术领域】，尤其是涉及一种用于转移性肾细胞癌鉴别诊断的双标免疫组化染色试剂盒。
【背景技术】
[0002]肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)占全身恶性肿瘤的2%?3%，在泌尿男性生殖系统恶性肿瘤中居第二位，约15%，仅次于膀胱癌。由于辅助检查手段的进步和人们对健康的日益关注，肾脏偶发癌在新发肾癌中的比率已经上升至60 %以上，而将近50 %的新发病例是病人在常规体检或因其他疾病检查B超时发现的。然而，新发病例中，约有20% -30%的病人在诊断时已经有转移；而又有25%的病人在根治性肾切除或保留肾单位的手术若干年后发生转移。
[0003]RCC临床进程难以预测，出现转移癌后，难以确定原发部位是其重要特点之一，并且肿瘤容易转移到少见部位，最常转移的部位是肺、骨、淋巴结、肝脏和腹膜后，其他少见部位为腰部、腹腔、肝脏、腰椎、脑组织、鼻中隔、食指、锁骨上及腮腺等。在转移灶的病理类型中，绝大多数为透明细胞性RCC。透明细胞性RCC其血管组织结构在一些肾外肿瘤中也可出现，并且多种肿瘤可以含有透明细胞成分，RCC组织也可以转移至这些器官，主要应和以下疾病鉴别:(1)透明细胞性肝细胞癌，⑵卵巢透明细胞癌、甲状腺透明细胞癌及肺透明细胞性腺癌，(3)中枢神经系统的毛细血管性血管母细胞瘤，(4)肾上腺皮质腺癌，(5)腺泡状软组织肉瘤与副神经节瘤。
[0004]传统的免疫组化检测通常一张切片只标记一种抗体，所带来的信息量较为有限，因此要求病理医师在显微镜下对不同的免疫组化进行切片逐一观察，才能做出最终的结果判定，一定程度上增加了病理医师的工作量，耗时费力。此外由于一些病变组织因为切面因素，影响染色结果的观察，同时活检标本量少，肿瘤细胞也可能因为切面而消失，给结果判定带来困难，因此，免疫组化多重染色检测方法显得尤为重要。
【发明内容】
[0005]针对上述现有技术存在的不足，为了克服转移性肾细胞癌组织学特征极易与肾上腺肿瘤、肺癌、肝癌、甲状腺癌等相混淆，不易确诊，常规免疫组化方法分别检测耗时费力，且穿刺活检标本组织量不够等不足，提供一种用于转移性肾细胞癌鉴别诊断的双标免疫组化染色试剂盒。使染色过程变得简单快捷，快速、方便的在同一张切片上可以得到丰富且对比性强的信息。
[0006]为实现上述的目的，本发明提供了以下技术方案:
[0007]一种用于转移性肾细胞癌鉴别诊断的双标免疫组化染色试剂盒，包括DAB显色液、由PAX8抗体和⑶10抗体的混合液混合形成的一抗和HRP酶标的二抗。
[0008]本发明进一步设置为:所述双标免疫组化染色试剂盒还包括苏木素、中性树胶、常规二甲苯、PH9.0的EDTA抗原修复液、蒸馏水、正常动物血清、3%过氧化氢、PBS,以及100%、100%、95%、85%、75% 梯度乙醇。
[0009]上述中检测方法中的一抗为两种混合型抗体。
[0010]本发明进一步设置为:所述两种混合型抗体为PAX8抗体和⑶10抗体的混合液。
[0011]本发明进一步设置为:所述采用的显色剂为DAB。
[0012]本发明进一步设置为:所述两种混合型一抗在同一切片同一时间同时反应，切片厚度为4μ m。
[0013]本发明进一步设置为:检测方法采用与混合型一抗对应的HRP酶标的二抗。
[0014]本发明的多重染色检测方法，包括以下步骤:
[0015](1)组织切片放入70°C恒温箱中干烤2h ；
[0016](2)常规二甲苯脱蜡3x10分钟，100%、100%、95%、85%、75%梯度乙醇，每道2-5分钟，最后蒸馏水冲洗；
[0017](3)在PH9.0的EDTA抗原修复液中直接煮沸修复，自然冷却至室温，蒸馏水冲洗，PBS冲洗3x3分钟；
[0018](4)在3%过氧化氢中室温孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3x3分钟；
[0019](5)用正常动物血清封闭10分钟，甩去多于血清，不洗，滴加混合一抗，置4°C冰箱过夜；
[0020](6) PBS冲洗3x3分钟，滴加二抗，室温孵育20分钟；
[0021](7)PBS冲洗3x3分钟，DAB显色，显微镜下检测显色过程，适时终止反应；
[0022](8)苏木素衬染，用中性树胶加盖玻片封固，利于显微拍照。
[0023]通过采用上述技术方案，本发明所达到的技术效果为:保持了混合性抗体中各个抗体通单染时同样的敏感性和特异性外，还具有染色步骤少，实验时间短、稳定性高、实验结果直观对比，所带来的信息量远比传统单染高等优点，尤其对于标本量少的活检病理诊断具有显著优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
[0025]图1为本发明实施例1的肾细胞癌免疫组化结果在显微镜下的低倍显示示意图。
[0026]图2为本发明实施例1的肾细胞癌免疫组化结果在显微镜下的高倍显示示意图。
[0027]图3为本发明实施例2的肾细胞细胞核单一着色在显微镜下的显示示意图。
[0028]图4为本发明实施例2的肾细胞膜单一着色在显微镜下的显示示意图。
[0029]PAX8以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，⑶10蛋白以细胞膜出现棕黄色颗粒染色为阳性细胞。400倍视野下选择5个以上高倍镜视野，连续计数1000个癌细胞，阳性细胞数< 10%为阴性，彡10%为阳性。取距肿块5cm外肾脏组织为对照的正常肾脏组织，对照组中PAX8、⑶10的阳性表达率均为0，RCC组织中它们的阳性表达率分别为80%和30%。
【具体实施方式】
[0030]参照图1?4，为本发明公开的用于转移性肾细胞癌鉴别诊断的双标免疫组化染色试剂盒检测肾细胞癌免疫组化的结果。
[0031]一种用于转移性肾细胞癌鉴别诊断的双标免疫组化染色试剂盒，包括DAB显色液、由PAX8抗体和⑶10抗体的混合液混合形成的一抗和HRP酶标的二抗。还包括苏木素、中性树胶、常规二甲苯、PH9.0的EDTA抗原修复液、蒸馏水、正常动物血清、3%过氧化氢、PBS,以及 100%、100%、95%、85%、75%梯度乙醇。
[0032]实施例1
[0033]研究对象为甲醛固定-石蜡包埋的转移性肾透明细胞癌组织(台州市中心医院病理科)，其化学实验步骤如下:
[0034]1、将组织切片放入70°C恒温箱中干烤2h。
[0035]2、常规二甲苯脱蜡3次，每次10分钟，100%、100%、95%、85%、75%梯度乙醇中水化，每道5分钟，最后蒸馏水冲洗。
[0036]3、在PH9.0的EDTA抗原修复液中直接煮沸修复，煮8_10分钟，保温10分钟，自然冷却至室温，蒸馏水冲洗，PBS冲洗3 X 3分钟。
[0037]4、在3%过氧化氢中室温孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3X3分钟。
[0038]5、用正常动物血清封闭10分钟，甩去多余血清，不洗，滴加一抗混合溶液，即PAX8抗体和⑶10抗体的混合液。
[0039]6、滴加与一抗对应的HRP酶标的二抗，室温孵育15分钟，PBS冲洗3X3分钟。
[0040]7、滴加DAB显色液，室温下孵育5-10min，显微镜下监测显色过程，适时终止反应。
[0041]8、苏木素复染，中性树胶加盖玻片封固，利于显微拍照。
[0042]如图1所示，显示肾细胞癌细胞核与细胞膜双着色。
[0043]实施例2
[0044]研究对象为甲醛固定-石蜡包埋的转移性肾透明细胞癌组织(台州市中心医院病理科)，
[0045]1、将组织切片放入70°C恒温箱中干烤2h。
[0046]2、常规二甲苯脱蜡3次，每次10分钟，100%、100%、95%、85%、75%梯度乙醇中水化，每道5分钟，最后蒸馏水冲洗。
[0047]3、在PH9.0的EDTA抗原修复液中直接煮沸修复，煮8_10分钟，保温10分钟，自然冷却至室温，蒸馏水冲洗，PBS冲洗3 X 3分钟。
[0048]4、在3%过氧化氢中室温孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3X3分钟。
[0049]5、用正常动物血清封闭10分钟，甩去多余血清，不洗，滴加PAX8抗体工作液。
[0050]6、滴加与一抗对应的HRP酶标的二抗，室温孵育15分钟，PBS冲洗3X3分钟。
[0051]7、滴加DAB显色液，室温下孵育5-10min，显微镜下监测显色过程，适时终止反应。
[0052]8、苏木素复染，中性树胶加盖玻片封固，利于显微拍照。
[0053]9、重复上述1-5步骤
[0054]10、用正常动物血清封闭10分钟，甩去多余血清，不洗，滴加⑶10抗体工作液。
[0055]11、滴加DAB显色液，室温下孵育5_10min，显微镜下监测显色过程，适时终止反应
[0056]12、苏木素复染，中性树胶加盖玻片封固，利于显微拍照。
[0057]如图3所示,显示肾细胞细胞核单一着色，图4所示显示肾细胞膜单一着色。
[0058]经过以上两种方法对比，可以看出实施例1明显步骤简单，结果直观对比，诊断结果可靠，而且同一切片不影响组织标本量多少，故将方法1作为最佳转移性肾细胞癌免疫组化双染检测方法。
[0059]上述方案中所述的各种试剂，除特别指出外，均可从商业途径上获得。
[0060]PAX8是一个配对盒基因，在甲状腺，苗勒管、肾/上泌尿道胚胎发育过程中起着重要的作用，并且表达于上述部位的肿瘤。研究发现，在恶性肿瘤中，PAX8表达于甲状腺肿瘤、肾细胞癌(RCCs)、高级别卵巢浆液性癌、非卵巢浆液性上皮肿瘤、宫颈上皮病变和子宫内膜腺癌中。其他如胸腺肿瘤、膀胱癌、肺鳞状细胞癌、睾丸混合性生殖细胞肿瘤、食管腺癌和胆管癌、胰腺癌、卵巢Sertol1-Leydig细胞瘤、卵巢性索-间质肿瘤和腺泡细胞癌等。这些结果表明，PAX8在证实来自于肾脏、甲状腺、苗勒氏管和胸腺的原发或转移性肿瘤中具有高度的敏感性和有价值。
[0061]⑶10(普通急性淋巴母细胞白血病抗原)是一个90_110kDa的表面糖蛋白，其功能是一个中性内肽酶，在一些正常组织表达，如肾小管上皮细胞刷状缘。⑶10为我们识别肾小管来源的肿瘤提供了一个有用的标记物，但同时它在多种来源的肿瘤组织中也有表达，如淋巴造血系统肿瘤、女性生殖系统肿瘤(子宫内膜间质肿瘤、混合型上皮和间质肿瘤等)及上皮来源肿瘤(结肠腺癌等)。因而有人认为，CD10敏感性强但一定程度上影响其特异性。我们认为，⑶10对于转移性RCCs的诊断为一个有效的抗体。
[0062]我们研究发现，PAX8+CD10联合应用于转移性肾细胞癌鉴别诊断，其特异性和敏感性均达到100%，即在转移性透明细胞肿瘤中联合应用PAX8和⑶10标记，PAX8标记细胞核，⑶10标记细胞膜，PAX8(+)⑶10(+)可百分之百确诊肾细胞癌转移。
[0063]上述实施例仅为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故:凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种用于转移性肾细胞癌鉴别诊断的双标免疫组化染色试剂盒，其特征在于:包括DAB显色液、由PAX8抗体和⑶10抗体的混合液混合形成的一抗和HRP酶标的二抗。
2.根据权利要求1所述的用于转移性肾细胞癌鉴别诊断的双标免疫组化染色试剂盒，其特征在于:所述双标免疫组化染色试剂盒还包括苏木素、中性树胶、常规二甲苯、PH9.0的EDTA抗原修复液、蒸馏水、正常动物血清、3%过氧化氢、PBS,以及100%、100%、95%、85%、75%梯度乙醇。
【文档编号】G01N33/574GK104297481SQ201410567190
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】卢洪胜, 章辉 申请人:卢洪胜