专利名称：乳腺癌的免疫组化诊断试剂盒和测试片的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学领域，涉及一种肿瘤诊断检测用品，进一步地，本发明涉及检测乳腺组织中Her2表达的测试片以及含该测试片的试剂盒。
背景技术：
乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤，在欧美国家的发病率占女性恶性肿瘤的首位。我国虽然属乳腺癌相对低发地区，但发病率正逐年上升。多数乳腺癌患者早期手术的预后较好，但约25-30％的患者的癌组织中有Her2受体的过度表达，这些患者的预后明显差于Her2低表达的患者，体现为手术后复发率高、病情发展迅速、化疗缓解期短，以及对化疗药物易产生耐药，无瘤生存率和总生存率均低于Her2阴性的乳腺癌。Her2在体内广泛分布，编码该蛋白的基因erbB-2，又称为neu基因，是人类肿瘤中发生改变频率最高的基因之一。美国肿瘤学会2000年曾推荐“Her2/neu”作为乳腺癌标记物，无论对诊断还是复发的检测都具有重要价值。
Her2是肿瘤靶向治疗的理想靶点之一，国内外制备了多种抗Her2单克隆抗体，发现它们可以显著抑制Her2阳性肿瘤细胞的体外、体内生长。由于鼠源抗体注射至人体后会产生严重的异种抗原反应，人们又对鼠源抗体进行了人源化改造，如1998年美国FDA批准了新型抗Her2人源化抗体用于治疗Her2阳性的转移性乳腺癌，该抗体即Herceptin，在临床试验和后续的应用中取得了十分确切的疗效。国内专利01132225.X也公开了一种抗Her2抗体，前期的临床前研究已经证实其可在体外与Her2受体阳性的乳腺癌细胞特异、可逆、高亲和力地结合，可抑制Her2阳性表达的肿瘤细胞的体外增殖，还可抑制Her2阳性表达的肿瘤细胞裸鼠异种移植模型的肿瘤生长。荷瘤小鼠注射该抗体后24～60小时检测发现，抗体集中分布于肿瘤组织中。
由于抗Her2单克隆抗体药物的适应症为Her2阳性的乳腺癌患者，因此在进行临床研究乃至今后临床应用时，需要确定备选患者肿瘤组织Her2抗原的表达情况。但是，目前已有的乳腺癌诊断试剂普遍存在操作程序烦琐，非特异性高的问题，不能简便、迅速、准确地判断患者肿瘤组织Her2抗原的表达情况。因此，目前医学上迫切需要开发一种能够快速、便捷且准确地进行乳腺癌体外诊断的用品。
发明内容
本发明的目的是提供一种在进行临床研究和诊断时，能够准确测定受试者乳腺组织的Her2抗原的表达情况的测试片。
本发明的另一目的是提供一种乳腺癌的免疫组织化学诊断试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种检测受试者肿瘤组织中Her2抗原表达水平的方法。
在本发明的一个方面，提供了一种检测乳腺组织中Her2表达的测试片，所述的测试片的一个主表面上具有以下区域(a)Her2高表达对照区，所述的高表达对照区设有Her2高表达的肿瘤组织切片；(b)Her2中表达对照区，所述的中表达对照区设有Her2中表达的肿瘤组织切片；(c)Her2无表达对照区，所述的无表达对照区设有Her2无表达的组织切片；(d)Her2检测区，所述的检测区用于放置待检测的乳腺组织。
作为本发明的一个优选例，在所述的检测乳腺组织中Her2表达的测试片中，所述Her2高表达的肿瘤组织切片选自D2F2/E2、HTB-20或SK-BR-3肿瘤组织切片。
作为本发明的一个优选例，在所述的检测乳腺组织中Her2表达的测试片中，所述Her2中表达的肿瘤组织切片选自KYC或LYX肿瘤组织切片。
作为本发明的一个优选例，在所述的检测乳腺组织中Her2表达的测试片中，所述Her2无表达的组织切片选自A431、QYC、MCF-7、RENCA肿瘤组织切片或Her2无表达的正常组织切片。
作为本发明的一个优选例，在所述的检测乳腺组织中Her2表达的测试片中，所述的组织切片为石蜡包埋的切片。
在本发明的第二方面，提供了一种乳腺癌的Her2免疫组化诊断试剂盒，其包含所述的检测乳腺组织中Her2表达的测试片。
作为本发明的一个优选例，在所述的乳腺癌的Her2免疫组化诊断试剂盒中，所述试剂盒中还包含免疫组化染色试剂，所述免疫组化染色试剂包含非特异性结合位点的阻断剂，与组织抗原连接的初始抗体，与初始抗体连接的第二抗体，酶，底物，显色剂。
作为本发明的一个优选例，在所述的乳腺癌的Her2免疫组化诊断试剂盒中，所述的初始抗体为抗Her2人源化单克隆抗体或鼠源抗Her2单克隆抗体，所述的第二抗体为生物素标记的抗人IgG或抗鼠IgG。
作为本发明的一个优选例，在所述的乳腺癌的Her2免疫组化诊断试剂盒中，所述的非特异性结合位点的阻断剂选自动物血清，白蛋白；所述的酶为辣根过氧化物酶；所述的底物为H2O2；所述的显色剂选自DAB-H2O2，AEC-H2O2，CN-H2O2。
在本发明的第三方面，提供了一种体外检测样品中Her2抗原表达水平的检测方法，所述的样品是肿瘤组织，该方法包括步骤将肿瘤组织制成切片；将所述切片置于所述测试片中的Her2检测区，进行免疫组化染色检测，将样品的染色情况与测试片上Her2高表达、中表达、无表达的组织切片的染色情况进行比对，结果判定如下染色情况≤Her2低表达区，判为阴性(-)；染色情况介于Her2低表达区和Her2中表达区之间，判为弱阳性(+)；染色情况介于Her2中表达区和Her2高表达区之间，判为中强阳性(++)；染色情况≥Her2高表达区，判为强阳性(+++)。
更特别的，在所述的检测方法中，所述Her2高表达的肿瘤组织切片选自D2F2/E2、HTB-20或SK-BR-3肿瘤组织切片；所述Her2中表达的肿瘤组织切片选自KYC或LYX肿瘤组织切片；所述Her2无表达的组织切片选自A431、QYC、MCF-7、RENCA或其它Her2无表达的组织切片。
图1显示了本发明的试剂盒中，组织切片在玻片上的分布示意图，其中，1、2和3分别表示Her2高表达、中表达、低表达对照区，4表示检测区。
图2显示了几种细胞呈现不同表达强度荧光的流式细胞术检测结果，其中，A表示LYX细胞的结果，其Her2无表达；B表示QYC细胞的结果，其Her2无表达；C表示MCF-7细胞的结果，其Her2无表达；D表示RENCA细胞的结果，其Her2无表达；E表示KYC的结果，其Her2中度表达；F表示LYX细胞的结果，其Her2中度表达；G表示SK-BR-3细胞的结果，其Her2高度表达；H表示HTB-20细胞的结果，其Her2高度表达；I表示D2F2/E2细胞的结果，其Her2高度表达。
图3显示了强阳、弱阳和阴性的切片组织的一些照片，其中，A为MCF-7(Her2无表达)；B为LYX(Her2中度表达)；C为D2F2/E2(Her2高度表达)；D为样品3(+)；E为样品5(++)；F为样品7(+++)。
具体实施例方式
由于目前已有的乳腺癌诊断试剂操作程序烦琐，非特异性高，不能迅速、准确的判断患者肿瘤组织Her2抗原的表达情况。因此，本发明提供了一种可简便地测试患者Her2抗原表达情况，进而可准确诊断病情。本发明人经过长期的研究，选取出Her2抗原表达水平呈高度、中度及无表达的多种不同的细胞，制备成具有良好均质性的组织，做成组织切片后置于一定的载体上。在检测时，将受试者的组织切片与对照切片同时进行染色，然后进行对比，即可判断出受试者的Her2表达情况。
本发明人选取Her2抗原表达水平呈高度、中度及无表达的多种不同的细胞，建立Balb/c裸鼠的异种移植模型，并使成瘤率大大提高。因为采用细胞系体外扩增及特异性免疫功能缺陷的裸鼠体内接种获得的肿瘤组织，实为单克隆的肿瘤细胞增殖的结果，因此，肿瘤组织具有良好的均质性，即肿瘤的不同部位，抗原表达水平一致。用这样的组织作为判定标准更为可靠，也使判定依据具有更好的稳定性。
应理解，现有技术中存在许多种Her2无表达的正常组织，这些Her2无表达的正常组织也可用于本发明。
本发明选取固定、石蜡包埋的切片，而非冰冻切片，在保证实验结果可靠的前提下，降低了对实验设备及方法难度的要求，易于普及。
在本发明中，手术切除的组织及活检获得的组织都可用于检测，降低了对受检组织的要求，扩大了可接受检测患者的范围。并且，受试者的肿瘤组织与Her2抗原呈不同表达水平的对照组织贴附于同一测试片，同时进行IHC染色，最大程度消除了操作过程微小变化对染色结果带来的误差。
本发明采用Her2表达水平呈高度、中度及无表达的明确肿瘤组织作为对照，可对IHC染色过程进行有效的监控，对IHC染色结果进行准确的评价，提高了检测结果的准确性，使假阳性和假阴性的结果都得到有效的控制。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，未详细说明的技术为常规技术。
实施例1 Her2抗原呈不同表达水平的肿瘤细胞的选择采用以下步骤进行肿瘤细胞的选择1)备选肿瘤细胞包括人肝癌细胞QYC，人肝癌细胞KYC，人肝癌细胞LYX，小鼠肾腺癌细胞RENCA，D2F2/E2(前述五种细胞获自第二军医大学国际合作肿瘤研究所)，人表皮癌细胞A431(购自上海午立生物技术有限公司)及MCF-7(获自美国国立癌症研究所)，SK-BR-3(购自上海午立生物技术有限公司)，HTB-20(购自广州维尔曼公司)。体外培养至对数生长期，分别取各种细胞进行荧光染色；2)细胞计数，将待测肿瘤细胞加入流式细胞仪专用检测管中，2×105/管，200g×5分钟离心，弃上清；3)用含1％小牛血清的PBS将rhHer2-mAb(获自第二军医大学国际合作肿瘤研究所)稀释至10μg/mL，加入上述流式管中，100μL/管，冰浴，避光孵育45分钟；4)含1％小牛血清的PBS洗涤细胞2次，每次均200g×5分钟离心，弃上清；5)用含1％小牛血清的PBS将FITC-羊抗人IgG(购自上海生物制品研究所)稀释至1μg/mL，加入上述流式管中，100μL/管，冰浴，避光孵育45分钟；6)含1％小牛血清的PBS洗涤细胞2次，每次均200g×5分钟离心，弃上清；7)将细胞沉淀用300μL含1％小牛血清的PBS重悬，用流式细胞仪进行检测，Her2表达越强的细胞结合的荧光标记抗体越多。
通过对照荧光强度，获得Her2抗原呈高度表达的D2F2/E2、SK-BR-3、HTB-20；Her2呈中度表达的LYX、KYC，Her2无表达的MCF-7、QYC、A431、RENCA细胞。上述几种细胞呈现不同表达强度的流式细胞检测结果显示在图2中。
实施例2表达Her2抗原均一性肿瘤组织的制备制备方法1)选取实施例1中获得的Her2分别呈现高度、中度、无表达的D2F2/E2、LYX及MCF-7三种肿瘤细胞，于含有10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中传代扩增，培养条件为5％ CO2，37℃及饱和湿度；2)对数生长期的三种细胞，PBS洗涤，200g×5分钟离心，弃上清，细胞沉淀重悬于PBS中，计数，调整细胞密度至1×107/mL；3)将肿瘤细胞悬液分别接种于Balb/c裸鼠颈部皮下，定期观察接种局部肿瘤生长情况及受试动物的一般情况；4)待肿瘤长至0.5cm3左右大小(肿瘤体积计算公式为x2y/2，其中x为肿瘤长径，y为肿瘤短径)，颈椎脱臼法处死受试动物，无菌摘取肿瘤组织；5)将肿瘤组织箭碎，研磨通过200目钢网；6)过钢网的细胞悬液用PBS洗涤，200g×5分钟离心，弃上清，细胞沉淀重悬于含有10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，进行原代肿瘤细胞体外培养，培养条件为5％CO2，37℃及饱和湿度；7)肿瘤细胞长至对数生长期，如上法，再次接种Balb/c裸鼠，定期观察接种局部肿瘤生长情况及受试动物的一般情况；8)待肿瘤长至0.5cm3左右大小(肿瘤体积计算公式为x2y/2，其中x为肿瘤长径，y为肿瘤短径)，颈椎脱臼法处死受试动物，无菌摘取肿瘤组织，再次进行原代培养，结果获得的三种肿瘤细胞D2F2/E2、LYX及MCF-7在Balb/c裸鼠体内的成瘤率已达100％；9)将前述获得的肿瘤细胞体外培养扩增，至对数生长期后接种于Balb/c裸鼠，定期观察接种局部肿瘤生长情况及受试动物的一般情况；10)待肿瘤长至0.5cm3左右大小(肿瘤体积计算方法与前述相同)，颈椎脱臼法处死受试动物，摘取肿瘤组织，固定于多聚甲醛。
实施例3肿瘤组织病理切片的制备及表面Her2抗原表达的检测1.制片1)多聚甲醛磷酸缓冲液的配制多聚甲醛40g，0.1mol/L pH7.4的PBS500mL，两者混合加热至60℃，搅拌并滴加1N NaOH至溶液清晰为止，冷却后加PBS至总体积为1000mL。
2)摘取肿瘤组织后，尽快处理取材的组织，力求保持组织新鲜，不干燥，组织块不可过大或过厚，尤其厚度不要超过1cm。
3)取材的组织固定于多聚甲醛磷酸缓冲液，固定液量要充足，至少20倍于组织的量，否则会造成固定液浓度降低，固定时间以完全浸透组织为宜(48小时)，固定时间过久可能会影响染色效果。
4)组织的脱水、透明、浸蜡整个操作过程中要掌握的原则是脱水透明要够而不过，浸蜡的温度不宜超过64℃，否则可能使抗原活性下降，降低检出率，或是造成组织焦脆，切片困难，具体程序如下表1。
5)从蜡缸拿出后用石蜡进行包埋。
6)载玻片的预处理载玻片的处理是做好免疫组化染色的重要步骤，本发明采用多聚左旋赖氨酸处理载玻片。
切片用石蜡切片机将包埋有组织的蜡块切成薄片，切片厚度4μm，45℃水温展片，要尽量展平，否则皱褶处易出现非特异染色。55℃温箱烤片2小时，防水密封，低温保存备用。
表1组织脱水、透明、浸蜡程序
7)石蜡切片的脱蜡至水石蜡切片脱蜡至水是组织脱水、透明、浸蜡和包埋的逆向过程，具体操作流程如下a)4μm石蜡切片，55℃温箱烤片18小时后开始脱蜡；b)二甲苯I、II和III级各10分钟；c)无水乙醇、90％乙醇、80％乙醇及70％乙醇各2分钟；d)自来水洗2-3分钟，进入IHC染色。
2.免疫组化(IHC)染色(1)热诱导的抗原修复1)热修复方法100℃水浴，10分钟×2；2)热修复的介质0.01mol/L pH6.0柠檬酸缓冲液。
通过抗原修复处理，可以提高抗原抗体阳性检测率。
(2)ABC法染色ABC法的特点是利用亲和素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。染色步骤如下1)切片常规脱蜡至水，PBS洗3×3分钟；2)3％过氧化氢(H2O2)孵育5分钟，用以清除内源性过氧化物酶反应；3)蒸馏水洗，PBS浸泡5分钟；4)稀释的正常小牛血清(阻断剂)，室温孵育20分钟；5)吸去多余的小牛血清；6)抗Her2人源化单克隆抗体或鼠源抗Her2单克隆抗体(获自第二军医大学国际合作肿瘤研究所)稀释至10μg/mL，37℃孵育60分钟或4℃过夜；7)PBS洗3×3分钟；8)生物素标记的抗人IgG或抗鼠IgG(购自晶美公司)，37℃孵育30-60分钟；9)PBS洗3×3分钟；10)ABC复合物(购自晶美公司)，37℃孵育30-60分钟；11)PBS洗3×3分钟；12)DAB-H2O2显色5-10分钟，水洗；13)苏木素复染、脱水、封固。
将制备的病理组织切片抽样检测，染色结果证实D2F2/E2、LYX及MCF-7肿瘤组织经如上所述的ICH染色法检测，其Her2抗原的表达水平分别呈高、中及无不同的水平，即显色呈强阳性、弱阳性及阴性。不同切片位置的组织染色结果均匀，表明肿瘤细胞在接种动物体内形成的肿瘤组织具有良好的均质性。因此，该组切片可用于检测肿瘤患者肿瘤组织Her2抗原的表达水平。
实施例4肿瘤患者肿瘤组织Her2抗原表达水平的检测获取10位肿瘤患者手术切除的肿瘤组织或活检获得的肿瘤组织，经与前述相同的方法固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后，将切片贴附于已制备好的检测用对照切片载片的另一端，而后利用相同的方法进行ICH的染色检测。
结果判断
D2F2/E2、LYX及MCF-7肿瘤组织染色情况须为强阳性、弱阳性及阴性，实验结果有效，按下述步骤进行判断，否则实验无效；患者肿瘤组织染色情况与D2F2/E2、LYX及MCF-7肿瘤组织染色情况进行比对，染色情况≤MCF-7，判为阴性(-)；染色情况介于MCF-7、LYX之间，判为弱阳性(+)；染色情况介于LYX、D2F2/E2之间，判为中强阳性(++)；染色情况≥D2F2/E2，判为强阳性(+++)，结果见表2。
表2
部分受试样品的切片的染色情况见图3，图3中可见，A为MCF-7，Her2无表达；B为LYX，Her2中度表达；C为D2F2/E2，Her2高度表达；D为样品3(+)；E为样品5(++)；F为样品7(+++)。
应理解，在阅读了本发明的上述公开内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请的权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种检测乳腺组织中Her2表达的测试片，其特征在于，所述的测试片的一个主表面上具有以下区域(a)Her2高表达对照区，所述的高表达对照区设有Her2高表达的肿瘤组织切片；(b)Her2中表达对照区，所述的中表达对照区设有Her2中表达的肿瘤组织切片；(c)Her2无表达对照区，所述的无表达对照区设有Her2无表达的组织切片；(d)Her2检测区，所述的检测区用于放置待检测的乳腺组织。
2.根据权利要求1所述的检测乳腺组织中Her2表达的测试片，其特征在于，所述Her2高表达的肿瘤组织切片选自D2F2/E2、HTB-20或SK-BR-3肿瘤组织切片。
3.根据权利要求1所述的检测乳腺组织中Her2表达的测试片，其特征在于，所述Her2中表达的肿瘤组织切片选自KYC或LYX肿瘤组织切片。
4.根据权利要求1所述的检测乳腺组织中Her2表达的测试片，其特征在于，所述Her2无表达的组织切片选自A431、QYC、MCF-7、RENCA肿瘤组织切片或Her2无表达的正常组织切片。
5根据权利要求1-4中任一所述的检测乳腺组织中Her2表达的测试片，其特征在于，所述的组织切片为石蜡包埋的切片。
6.一种乳腺癌的Her2免疫组化诊断试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的检测乳腺组织中Her2表达的测试片。
7.根据权利要求6所述的乳腺癌的Her2免疫组化诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含免疫组化染色试剂，所述免疫组化染色试剂包含非特异性结合位点的阻断剂，与组织抗原连接的初始抗体，与初始抗体连接的第二抗体，酶，底物，显色剂。
8.根据权利要求7所述的乳腺癌的Her2免疫组化诊断试剂盒，其特征在于，所述的初始抗体为抗Her2人源化单克隆抗体或鼠源抗Her2单克隆抗体，所述的第二抗体为生物素标记的抗人IgG或抗鼠IgG。
9.根据权利要求7所述的乳腺癌的Her2免疫组化诊断试剂盒，其特征在于，非特异性结合位点的阻断剂选自动物血清，白蛋白；所述的酶为辣根过氧化物酶；所述的底物为H2O2；或者所述的显色剂选自DAB-H2O2，AEC-H2O2，CN-H2O2。
10.一种体外检测样品中Her2抗原表达水平的检测方法，所述的样品是肿瘤组织，其特征在于，该方法包括步骤将肿瘤组织制成切片；将所述切片置于权利要求1所述的检测乳腺组织中Her2表达的测试片中的Her2检测区，进行免疫组化染色检测，将样品的染色情况与测试片上Her2高表达、中表达、无表达的组织切片的染色情况进行比对，结果判定如下染色情况≤Her2低表达区，判为阴性(-)；染色情况介于Her2低表达区和Her2中表达区之间，判为弱阳性(+)；染色情况介于Her2中表达区和Her2高表达区之间，判为中强阳性(++)；染色情况≥Her2高表达区，判为强阳性(+++)。
全文摘要
本发明公开了一种检测乳腺组织中Her2表达的测试片，所述的测试片的一个主表面上具有Her2高表达对照区、Her2中表达对照区、Her2无表达对照区以及用于放置待检测的乳腺组织的Her2检测区。本发明还公开了乳腺癌的Her2免疫组化诊断试剂盒和检测方法。本发明能够准确测定受试者乳腺组织的Her2抗原的表达情况，为乳腺癌的临床诊断提供了准确的评判标准。
文档编号G01N33/574GK1928563SQ20051002953
公开日2007年3月14日 申请日期2005年9月9日 优先权日2005年9月9日
发明者郭亚军, 王皓, 侯盛, 钱卫珠 申请人:上海张江生物技术有限公司