专利名称：一种免疫组化用二抗显色系统灵敏度、亲和力的测定方法
技术领域：
本发明属于生物病理检测领域，具体的，本发明涉及一种免疫组化用二抗显色系统灵敏度、亲和力的测定方法。
背景技术：
免疫组化技术是应用抗原抗体反应的基本原理，通过化学反应使标记抗体的显色齐U(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来确定、观察组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量研究的一项技术。其中显色过程多为标记的第二抗体承担。免疫组化技术最终要在二抗上面体现，因此二抗的特异性及其灵敏度在一定程度上决定了检测过程的特异性和灵敏度。如何使抗体能与抗原有效地结合并将此信号进行放大，是衡量免疫组化技术的两项重要指标。围绕信号放大这一要求，不断有新的问世。目前具有代表性的二抗放大系统主要用生物素与亲和素系统、高分子葡聚糖载体结合多个二抗和辣根酶系统等。不同公司基于二抗放大产品由于生产的方法不同，其在免疫组化应用中各有差异。如何评价二抗在免疫组化过程中的灵敏度、亲和力，对于产品的指标控制十分重要。目前评价的主要方法是通过在病理组织上根据其显色的深浅进行人为的判定，具有极大的随意性。本发明提供了一种在玻片上评价二抗显色系统灵敏度及其亲和力的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于免疫组化过程进行二抗显色系统灵敏度和亲和力测定的技术。随着免疫组化技术在临床诊断和肿瘤转化诊断中的应用，医院病理工作者对免疫组化灵敏度的要求越来越高。选择高灵敏度、高亲和力、显色效果明显的二抗系统，对免疫组化的检测结果判断具有重要的作用。本发明中，采用一抗在载玻片上点样矩阵模型，作为二抗的检测底物，进行免疫组化二抗显色系统灵敏度和亲和力的测定。将可以与二抗发生特异性免疫反应的不同浓度的一抗预先在玻片上进行点样，真空干燥后，加石蜡封闭，然后经过脱蜡、水化、修复、二抗反应、显色等步骤。或是经过包埋的不同浓度一抗的石蜡切片预先放置在玻片上，经过切片、捞片、烤片、脱蜡、水化、修复、二抗反应、显色等步骤。将显色结果进行拍照，采用软件识别系统对每个点样点的显色结果进行计算，获得其光密度值。为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下:
一种免疫组化用二抗显色系统灵敏度、亲和力的测定方法，所述测定方法包括下列工艺步骤:将能与二抗发生特异性免疫反应的一抗按不同稀释的浓度预先吸附在玻片上，一个浓度的一种多肽在玻片上经上样后形成一个小圆斑；或是将经过包埋的不同浓度的一抗石蜡切片预先放置在玻片上，与病理组织切片同时经历常规免疫组化操作步骤，以特定一抗的染色结果来判定免疫组化过程二抗显色系统的灵敏度及亲和力。所述预先吸附在玻片上是以物理吸附的方式，吸附在免疫组化用的玻片上。
所述常规免疫组化操作步骤包括:干燥、石蜡作用、脱蜡、水化、修复、二抗反应、染色。所述石蜡作用是将一抗点样在玻片上并干燥后，将玻片加入熔化的石蜡中浸泡，保证点样位置浸泡于石蜡中，然后将载玻片取出冷却固化。所述一抗的染色结果，是指一抗的斑点颜色从浓度由低到高表现为逐渐加深的现象；再通过显微镜对病理组织切片进行观察，根据病理组织切片上靶位颜色可显示的最低浓度判定检测一抗的最低浓度，以确定二抗检测系统的灵敏度。如某一排一抗点样浓度的斑点无明显的显色反应，而上一浓度的斑点显色且颜色肉眼可辨，则该浓度的上一浓度的一抗浓度为检测二抗系统的灵敏度值。所述以特定一抗的染色结果来判定免疫组化过程二抗显色系统的灵敏度及亲和力的具体方法为:对染色结果进行拍照，用图像软件对呈色斑点进行光密度测量，通过对应一抗浓度与光密度，计算二抗检测系统与一抗的亲和力；一抗与二抗结合显示的光密度值达到饱和值50%时，其一抗的浓度即为该二抗显色系统的亲和力指数，以呢/L表示，通过比较不同来源二抗样品的亲和力指数衡量二抗的亲和力高低。本发明的显著优点:目前免疫组化方面还未有评价二抗质量的有效方法，更未有产品面世。本发明提供了一种新型的可用于评价免疫组化用二抗的新技术与方法，本发明制备的产品，用于与免疫组化染色过程一致，应用简单方便。免疫组化(Immunohistochemistry)是应用抗原抗体反应的基本原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来确定、观察组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量研究的一项技术，如何使抗体能与抗原有效地结合并将此信号进行放大，是衡量免疫组化技术的两项重要指标。围绕信号放大这一要求，不断有新的技术问世。目前最常用的是间接法，通过多个酶标二抗与一抗的不同决定簇反应，使每个靶点上有更多的酶分子结合，从而放大了信号，具有代表性的二抗放大检测系统主要用生物素与亲和素系统、高分子葡聚糖载体结合多个二抗和辣根酶系统等，因此二抗检测系统的特异性及其灵敏度在一定程度 上决定了检测过程的特异性和灵敏度。不同公司基于二抗放大检测产品由于生产的技术及方法有所不同，其在免疫组化应用的结果中各有差异。如何评价二抗放大检测系统在免疫组化过程中的灵敏度、亲和力，对于产品的指标控制十分重要。目前二抗放大检测系统评价的主要方法是通过在病理组织上根据其显色的深浅进行人为定性的判定，主观影响因素较大。针对二抗放大检测系统在免疫组化应用的特点，本工作模拟免疫组化过程，将一抗蛋白固定于载玻片上，作为参比蛋白用于病理组织染色中的二抗质控评价标准，评价过程客观，可数据化，结果准确。
图1为实施例1中不同浓度的鼠抗体IgG检测二抗显色系统的灵敏度的染色结果；其中从上到下一次为 10吒/1、2吒/1、0.4Pg/L、0.08Pg/L、0.016Pg/L、0.00321^/L、0.00064Mg/L浓度的鼠抗体IgG,最后一排为lmg/mL的羊血清阴性对照；
图2为实施例2中不同浓度的鼠抗体IgG检测二抗显色系统的灵敏度的染色结果；其中从上到下一次为 10吒/1、2吒/1、0.4l^g/L、0.08Pg/L、0.016l^g/L、0.0032l^g/L、0.000641 /L浓度的鼠抗体IgG,最后一排为lmg/mL的羊血清阴性对照。
具体实施例方式下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是不能以此限制本发明的范围。实施例1:
通过商业途径购买或通过克隆方式获得的鼠抗体IgG，用0.lmol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS，下同)分别稀释成 10吒/1、2吒/1、0.4Pg/L、0.08Pg/L、0.016Pg/L、0.00321^/L、0.00064l^g/L的浓度，然后在玻片上部靠近贴标签的部位，采用lmg/mL山羊血清作为阴性对照，每排点四个浓度一样的一抗斑点，每个斑点点Img量，按多肽浓度从低到高的顺序依次点样。点完后放在真空干燥箱中50° C干燥30min，取出后放入融化的蜡液中Imin取出，冷却至石蜡凝固后保存。
检测时，公认的二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水(二甲苯I 20min—二甲苯II 20min—100%酒精 IOmin — 100% 酒精 IOmin — 95% 酒精 5min — 80% 酒精 5min — 70% 酒精 5min)，PBS冲洗3次，每次5min ;取出后正常羊血清工作液封闭，37°C lOmin，倾去勿洗。滴加抗ER的一抗，4°C冰箱孵育过夜，PBS冲洗3次。每次5min ;加入福州迈新生物科技开发有限公司购买的Elivision 二抗显色系统，根据二抗系统说明书推荐的方式添加，使其覆盖各个斑点，，室温孵育15min,磷酸盐缓冲液冲洗3次,每次3min。然后加入DAB显色液,室温孵育5min,自来水冲洗终止显色。经梯度酒精脱水干燥，中性树胶封片后观察。根据多肽斑点显色差异，判断显色系统的灵敏度。如某一排斑点无明显的显色反应，且上一浓度的斑点颜色肉眼可辨，则该浓度的上一浓度的一抗浓度即为检测二抗系统的灵敏度值。10吒/1、2吒/1、0.4l^g/L、0.08Pg/L、0.016Pg/L、0.0032l^g/L、0.00064l^g/L 的斑点中(图1)，0.0064^/L斑点颜色无法判断且与阴性对照斑点无差异，而0.00321^/L颜色肉眼可辨，与阴性对照差异显著，则该二抗系统的检测灵敏度为0.00321^/L。
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将玻片照相，通过Photoshop分析每个斑点的光密度，以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，得出其光密度值饱和时的斑点的一抗浓度为2Pg/L，其光密度值为饱和值一半时对应的浓度值为0.517吒/L。则该二抗的灵敏度为0.00321^/L，亲和力指数为0.517^/L0其亲和力指数小于普通二抗系统的1.0Pg/L。说明该二抗显示系统的亲和力强(亲和力指数越小，表明一抗与二抗的结合能力越强)。实施例2
称取0.2g脱脂奶粉，溶解于IOmL双蒸水中，再分别加用PBS稀释的10l^g/L、2l^g/L、
0.4Pg/L、0.08Pg/L、0.016Pg/L、0.0032l^g/L、0.00064^/L 的浓度小鼠 IgG，充分搅拌溶解。再分别称取0.2g葡聚糖加入到上述溶液中，搅拌后分别加入20 y L乙酸，不断搅拌使葡聚糖彻底溶解，4°C放置除去葡聚糖溶液中的气泡。用一次性注射针头将葡聚糖溶液打到I摩尔/L的氢氧化钠溶液中固化，形成白色固体颗粒。获得的固体颗粒进行与病理组织同样的程序，经过梯度酒精脱水(脱水的步骤:80%、90%、95%、100%各种浓度的乙醇分别脱水2小时)，用二甲苯透明，石蜡浸泡，最后石蜡包埋制作成石蜡标本。然后将每一点的石蜡(即分别包埋有不同上述浓度的IgG)，用打孔器取直径为3毫米、长为5毫米左右的蜡块，按照每个浓度一排放置(每排4个)，共放置7排，最后靠近标签的一排放置lmg/mL的预先包埋的羊血清作为阴性对照，点好样后将整个玻片放入融化的石蜡中。等石蜡冷却后，将放置有8排石蜡条的石蜡块，按照公认的标准的程序各组织取一片进行切片、载玻片贴片。烤片，68°C，20min，公认的二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水(二甲苯I 20min—二甲苯II 20min—100%酒精 IOmin — 100% 酒精 IOmin — 95% 酒精 5min — 80% 酒精 5min — 70% 酒精 5min)，PBS冲洗3次，每次5min ;取出后进行抗原修复:置0.0lM枸橼酸缓冲液(PH6.0)中煮沸(95°C，15-20min),自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3次，每次5min。正常羊血清工作液封闭，37°C lOmin，倾去勿洗。加入迈新生物科技开发有限公司购买的Maxviosn 二抗显色系统，根据二抗系统说明书推荐的方式添加，使其覆盖各个斑点，室温孵育15min,磷酸盐缓冲液冲洗3次,每次3min。然后加入DAB显色液,室温孵育5min,自来水冲洗终止显色。经梯度酒精脱水干燥，中性树胶封片后观察。根据多肽斑点显色差异，判断显色系统的灵敏度。如某一排斑点无明显的显色反应,且上一浓度的斑点颜色肉眼可辨,则该浓度的上一浓度的一抗浓度为检测二抗系统的灵敏度值。10吒/1、2吒/1、0.4l^g/L、0.08Pg/L、0.016Pg/L、0.0032l^g/L、0.00064l^g/L 的斑点中(图2)，0.00321^/L斑点颜色无法判断且与阴性对照斑点无差异，而0.0161^/L颜色肉眼可辨，与阴性对照差异显著，则该二抗系统的检测灵敏度为0.0161^/L。将玻片照相，通过Photoshop分析每个斑点的光密度，以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，得出其光密度 值饱和时的斑点的一抗浓度为2Pg/L，其光密度值为饱和值一半时对应的浓度值为0.737 吒/L。则该二抗的灵敏度为0.0161^/L，亲和力指数为0.737Pg/L。其亲和力指数小于普通二抗系统的1.0Pg/L。说明该二抗显示系统的亲和力强(亲和力指数越小，表明一抗与二抗的结合能力越强)。
权利要求
1.一种免疫组化用二抗显色系统灵敏度、亲和力的测定方法，其特征在于:所述测定方法包括下列工艺步骤:将能与二抗发生特异性免疫反应的一抗按不同稀释的浓度预先吸附在玻片上，一个浓度的一种多肽在玻片上经上样后形成一个小圆斑；或是将经过包埋的不同浓度的一抗石蜡切片预先放置在玻片上，与病理组织切片同时经历常规免疫组化操作步骤，以特定一抗的染色结果来判定免疫组化过程二抗显色系统的灵敏度及亲和力。
2.根据权利要求1所述的一种免疫组化用二抗显色系统灵敏度、亲和力的测定方法，其特征在于:所述预先吸附在玻片上是以物理吸附的方式，吸附在免疫组化用的玻片上。
3.根据权利要求1所述的一种免疫组化用二抗显色系统灵敏度、亲和力的测定方法，其特征在于:所述常规免疫组化操作步骤包括:干燥、石蜡作用、脱蜡、水化、修复、二抗反应、染色。
4.根据权利要求2所述的一种免疫组化用二抗显色系统灵敏度、亲和力的测定方法，其特征在于:所述石蜡作用是将一抗点样在玻片上并干燥后，将玻片加入熔化的石蜡中浸泡，保证点样位置浸泡于石蜡中，然后将载玻片取出冷却固化。
5.根据权利要求1所述的一种免疫组化用二抗显色系统灵敏度、亲和力的测定方法，其特征在于:所述一抗的染色结果，是指一抗的斑点颜色从浓度由低到高表现为逐渐加深的现象；再通过显微镜对病理组织切片进行观察，根据病理组织切片上靶位颜色可显示的最低浓度判定检测一抗的最低浓度，以确定二抗检测系统的灵敏度。
6.根据权利要求1所述的一种免疫组化用二抗显色系统灵敏度、亲和力的测定方法，其特征在于:所述以特定一抗的染色结果来判定免疫组化过程二抗显色系统的灵敏度及亲和力的具体方法为:对染色结果进行拍照，用图像软件对呈色斑点进行光密度测量，通过对应一抗浓度与光密度，计算二抗检测系统与一抗的亲和力；一抗与二抗结合显示的光密度值达到饱和值50%时，其一抗的浓度即为该二抗显色系统的亲和力指数，以Pg/L表示，通过比较不同来源二抗样品的亲和力指数衡量二抗的亲和力高低。
全文摘要
本发明提供了一种免疫组化用二抗显色系统灵敏度、亲和力的测定方法，将能与二抗发生特异性免疫反应的一抗按不同稀释的浓度预先吸附在玻片上，一个浓度的一种多肽在玻片上经上样后形成一个小圆斑；或是将经过包埋的不同浓度的一抗石蜡切片预先放置在玻片上，与病理组织切片同时经历常规免疫组化操作步骤，以特定一抗的染色结果来判定免疫组化过程二抗显色系统的灵敏度及亲和力。
文档编号G01N21/78GK103116029SQ201310031750
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者林齐心, 陈赞烽, 熊玉林, 王小亚 申请人:福州迈新生物技术开发有限公司