一种快速、准确、重复性好的口蹄疫疫苗抗原146s测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及对口蹄疫疫苗抗原146S进行定量分析，具体涉及用尺寸排阻高效液 相色谱柱和高效液相色谱系统及方法定量病毒液中口蹄疫抗原146S含量的方法。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫病毒样品中与刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞有关的主要是完整病毒 颗粒，其沉降系数为146S，被认为与口蹄疫疫苗的效率具有平行关系。因此146S的含量是 评价口蹄疫疫苗质量的一个重要指标。146S稳定性弱，例如在温和加热或pH低于6. 0的条 件下即会发生裂解，而裂解后的产物的免疫原性极低。因此对于口蹄疫疫苗的生产过程中 及疫苗成品的储存过程中146S的定量都尤为重要，需要建立快速、准确的定量方法。
[0003] 目前已有报道的口蹄疫抗原定量技术主要有：（1)细胞半数感染量（TCID50)测 定；（2)补体结合试验（CFT) ; (3)免疫扩散法；(4) ELISA定量法；（5)蔗糖密度梯度离心法； (6)凝胶过滤色谱法。方法（1)检测的是病毒活力，而并不能准确反映免疫原性；方法（2) 由于容易受到前补体和抗补体因子的干扰，准确性和稳定性差；方法（3)和（4)由于需要 针对不同的抗原获取相应抗体，成本高，周期长，且难以完全区分146S及146S的抗原降解 物；方法（5)是目前国际上经典的检测口蹄疫抗原的方法，但此方法仪器成本较高，检测时 间长（每个样品需要几个小时），需要的样品量较多（至少若干毫升），且离心前需要浓缩， 操作相对复杂，尽管该方法已经进行了改进，可以自动配置蔗糖梯度和取样分析检测，但仍 难以满足快速检测的需要；方法（6)是2011年Spitteler等（Spitteler MA, Fernandez I,Schabes E, Krimer A, Regulier EG, Guinzburg M, et al. Vaccine. 2011 ；29:7182-7187) 首次建立的用凝胶过滤色谱法在口蹄疫疫苗纯化过程中进行146S定量。
[0004] 凝胶过滤色谱法是根据样品的尺寸大小进行分离，同时检测吸收峰，根据吸收 峰的峰面积进行计算定量。该种方法相对于蔗糖密度梯度离心法更易标准化，可准确进 行146S的体外定量和批次间检测，与蔗糖密度离心法具有良好的结果一致性。文献中 Spitteler等采用的是S印hacryl S-400凝胶过滤色谱填料及AKTA色谱纯化系统。这种 方法为了达到高的柱效以实现分离目的，需要较长的色谱柱，从而分析时间较长，填料的成 本较高，且所需样品量依然较多。专利CN 102998378 B公开了一种利用液相色谱系统定量 口蹄疫抗原中146S含量的方法，但是该方法由于仅仅是利用了液相色谱系统的检测系统， 因此只能对纯化后的146S进行检测，无法检测含有杂质的抗原。
[0005] 本发明的方法是利用高效液相色谱系统及尺寸排阻高效液相色谱柱定量分析口 蹄疫抗原146S。尺寸排阻高效液相色谱柱由于其填料的尺寸小，耐压强，能在短的色谱柱高 度下达到高的理论塔板数，实现样品的分离和检测，从而相比Spitteler等的方法极大的 减短了检测时间和样品体积，与专利CN 102998378 B相比，可以对未经纯化的抗原进行检 测。使用精度和准确性高的高效液相色谱系统，在微量进样条件下仍能准确控制样品体积， 从而保证了结果的准确性和稳定性。本方法可用于监测多种口蹄疫疫苗在生产和储存过程 中的抗原含量，间接评价疫苗效力。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、准确、低样品量的测定各种口蹄疫 抗原146S的方法。
[0007] 基于以上目的，本发明提供了一种用尺寸排阻高效液相色谱法定量口蹄疫146S 抗原的方法，包括以下步骤：
[0008] (1)将尺寸排阻高效液相色谱柱连接在高效液相色谱仪上，以PH大于7的缓冲溶 液作为流动相，打开高效液相色谱仪的泵送系统和紫外检测系统，对尺寸排阻高效液相色 谱柱进行冲洗和恒温，注意排出系统内任何残留的气泡。
[0009] (2)标准曲线的绘制：将146S纯品用缓冲溶液配置成不同浓度的标准溶液样品， 其样品数量应该大于3个，浓度范围为0. 2-60 μ g/ml。取标准溶液样品进样量100 μ 1，按 照高效液相色谱仪的操作对尺寸排阻高效液相色谱柱进样分析，洗脱液采用0.1 M硫酸钠 的磷酸缓冲液（ΡΗ7. 0-7. 5)，流速：0. 5-1.0ml/min ;色谱柱流出液在紫外波长下进行检测。 对抗原的吸收峰进行积分得到峰面积，与标准品中146S的浓度建立线性回归方程。
[0010] (3)待测样品的测定：将待测样品通过系统向尺寸排阻高效液相色谱柱进样，采 用与（2)同样的洗脱液和紫外波长检测，对抗原的吸收峰进行积分得到峰面积，根据（2)中 建立的146S浓度与峰面积的线性回归方程，算得待测样品中146S的浓度。
[0011] 样品测试时，对未经纯化的口蹄疫疫苗中间品样品，步骤⑶中的样品检测前需 进行核酸酶处理：取100-200 μ 1，加入终浓度为10U/ml DNase和2. 5U/ml RNase，37°C反应 0. 5-lh后再进行尺寸排阻高效液相色谱法检测。对已加入佐剂的疫苗成品，需进行破乳预 处理，破乳条件为：按照疫苗原液体积1/9加入正丁醇，混匀后在4°C下静置Ih后，5000rpm 离心2min，收集含抗原的底层溶液进行检测。
[0012] 此项检测技术具有以下优势：
[0013] 检测速度快，传统的蔗糖密度梯度离心方法每个样品需要3-5小时，加上浓缩抗 原的时间，最多需要2天。文献报道的凝胶过滤色谱法每个样品的检测需要2h而本方法建 立标准曲线后，每个样品的检测时间可减少到30min。
[0014] 高灵敏度，低样品体积。该方法可以检测至24ng的146S，样品体积仅需 10-100 μ 1，样品不需要提前浓缩，而传统的蔗糖密度梯度离心及制备级凝胶过滤色谱法需 要的样品在毫升级，且浓缩过程中可能导致抗原损失。
[0015] 重复性好，批次内误差小。由于高效液相色谱系统实现全自动分析，从上样到检测 都由仪器自动化控制，相对密度梯度离心的人工操作误差小，检测结果更准确。
[0016] 具有广泛的实用性，可用于不同血清型或亚型的病毒抗原的检测。
[0017] 因此，本发明解决了当前口蹄疫病毒抗原检测操作复杂，检测时间长，重复性差的 问题。对于提升我国口蹄疫疫苗生产过程中及疫苗成品的质量控制具有重要意义。
【附图说明】
[0018] 下面结合附图对本发明做进一步说明。
[0019] 图1为实施例（1)中蔗糖密度梯度离心法收集的146S抗原的SDS-PAGE检测结果 (A)和 western blot 检测（B) ο
[0020] 图2为实施例（I)中蔗糖密度梯度离心法收集的146S抗原的透射电子显微镜检 测图片。
[0021] 图3为实施例（2)中蔗糖密度梯度离心收集的纯146S标准品的尺寸排阻高效液 相色谱法检测图谱。
[0022] 图4为实施例（2)中不同稀释浓度下的纯146S抗原的吸收峰面积与浓度的线性 关系；
[0023] 如图所示，该曲线的R2达到0. 9991，线性结果良好。
[0024] 图5为实施例（3)尺寸排阻高效液相色谱法检测不同血清型的口蹄疫146S抗原 的检测图谱。
[0025] 图6为实施例（4)中用核酸酶处理不同时间后检测未经纯化的疫苗中间品的检测 图谱。
[0026] 图7为实施例（5)中56°C加热不同时间后疫苗的尺寸排阻高效液相色谱图。
[0027] 图8为实施例（5)中不同温度下口蹄疫疫苗中146S抗原含量随加热时间的变化。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例来进一步说明本发明。这些实施例仅是范例性的，并不对本 发明的范围构成任何限制。本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明 方案的细节和形式进行修改，在没有做出创造性劳动前提下的所有其它实施例，都属于本 发明保护的范围。
[0029] 实施例1 口蹄疫抗原146S标准品的制备
[0030] 1.材料
[0031] (1)检测样品：0型口蹄疫灭活病毒液来自于兰州兽医研宄所
[0032] (2)仪器和试剂：超速离心机为Sorvall WX Ultra，转子为Su