疫苗佐剂制备中的亲水过滤的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是2010. 12. 03提交的CN201080056000. 3,题为"疫苗佐剂制备中的亲水过 滤"的分案申请。
[0002] 本申请要求2009年12月3日提交的美国临时申请61/283, 517的优先权，其通过 引用全文纳入本文以用于所有目的。
技术领域
[0003] 本发明涉及例如通过微流化制备疫苗的水包油乳液佐剂的领域。 技术背景
[0004] 称作'MF59' [1-3]的疫苗佐剂是一种鲨烯、聚山梨酯80 (也称作吐温80)和去水 山梨糖醇三油酸酯（也称作司盘85)的亚微米水包油乳液。它也可包含柠檬酸根离子，如 IOmM柠檬酸钠缓冲剂。该乳液的体积组成可以是约5%角鲨烯、约0. 5%吐温80和约0. 5% 司盘85。参考文献4的第10章、文献5的第12章、文献6的第19章更详细地描述了该佐 剂及其制备。
[0005] 如参考文献7所述，MF59的商业规模的制备是通过将司盘85分散在鲨烯相中且 吐温80分散在水相中，然后高速混合得到粗乳液。然后将这种粗乳液重复通过微流化床， 产生具有均一油滴尺寸的乳液。如参考文献6所述，然后将微流化乳液滤过0. 22 μ m膜，以 除去任何大油滴，得到乳液的平均液滴尺寸在4°C下保持至少3年不变。可用参考文献8中 所述的方法测定最终乳液中的鲨烯含量。
[0006] 许多文献（例如参考文献9-12)描述了可通过微流化然后经0. 22 μ m聚砜滤膜过 滤除菌来制备MF59。聚砜是在主要聚合物主链中含有砜基（SO2)的聚合物，聚砜滤膜公知 是疏水滤膜。
[0007] 本发明的目的是提供另一种制备微流化水包油乳液（例如MF59)的改良方法，特 别是适合用于商业规模和使用过滤的方法。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种制备含有鲨烯的水包油乳液的方法，其中该方法包括步骤：（i) 制备具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，也称作初始乳液或预乳液；（ii)微流化第一乳液 形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和（iii)用亲水膜过滤 第二乳液。
[0009] 本发明还提供了一种制备水包油乳液的方法，其包括步骤：⑴制备具有5000nm 或以下的第一平均油滴尺寸的第一乳液，也称作初始乳液或预乳液；（ii)微流化第一乳液 形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和（iii)用亲水膜过滤 第二乳液。
[0010] 本发明还提供了一种制备水包油乳液的方法，其包括步骤：（i)制备具有第一平 均油滴尺寸的第一乳液，也称作初始乳液或预乳液；（ii)微流化第一乳液形成具有比第一 平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和（iii)用亲水聚醚砜膜过滤第二乳 液。
[0011] 可任选地，第一乳液可用匀质器如下所述制备。
[0012] 如下文详述，第一乳液可具有5000nm或以下的平均油滴尺寸，例如平均尺寸为 300nm-800nm。如下所述，第一乳液中尺寸>1.2μπι的油滴数量为5 X10n/ml或以下。尺寸 >1. 2 μπι的油滴是不利的，因为它们由于液滴凝聚和聚结能导致乳液不稳定[14]。
[0013] 形成后，第一乳液可随之至少通过一次微流化，形成平均油滴尺寸减小的第二乳 液。如下所述，第二乳液中的平均油滴尺寸为500nm或以下。如下所述，第二乳液中尺寸 >1. 2 μπι的油滴数量为δχΙΟ1%^或以下。为了实现这些特征，必须将乳液组分通过微流化 装置多次，例如2、3、4、5、6、7次。
[0014] 然后第二乳液可经亲水膜过滤，例如亲水聚醚砜膜，得到可适用作疫苗佐剂的水 包油乳液。过滤后产生的水包油乳液的平均油滴尺寸为220nm或以下，例如135-175nm， 145-165nm，或约155nm。过滤后产生的水包油乳液中存在的尺寸>1. 2 μπι的油滴数量可以 是5x 108/ml或更少，例如5x 107/ml或更少，5x 106/ml或更少，2x 106/ml或更少，或5χ 105/ml或更少。
[0015] 过滤后形成的最终水包油乳液中尺寸>1. 2 μΜ的油滴可比第一乳液以少至少IO2 倍，理想的是至少少IO3倍（例如少10 4倍）。
[0016] 在一些实施方式中，在步骤（iii)之前进行一轮以上的步骤（i)和（ii)。类似的， 可多次重复独立步骤（i)和（ii)。
[0017] 本发明还可用于制备不利用微流化的水包油乳液，例如用于依靠其它技术如热可 逆性的方法[40]。在这些实施方式中，本发明提供了一种制备含有鲨烯的水包油乳液的方 法，其中该方法包括步骤：（i)制备平均油滴尺寸在1 μπι以下（例如500nm以下，250nm以 下，200nm以下，150nm以下，IOOnm以下）的水包油乳液；和（ii)用亲水膜过滤该乳液。 因此，这些实施方式利用了亲水膜对制备含鲨烯的水包油乳液的适用性，但不需要预先使 用微流化。
[0018] 类似的，本发明提供了亲水膜制备水包油乳液佐剂的用途。下文描述了膜和乳液 佐剂的其它特征。
[0019] 一般，本发明的方法在20-60°C，理想地在40±5°C进行。虽然第一和第二乳液组 分可能在较高温度下也相对稳定，但一些组分的热分解仍然会发生，因此优选较低温度。
[0020] 乳液组分
[0021] 可用动态光散射技术如参考文献13所述测定平均油滴尺寸（即乳液油滴的平均 直径数）。动态光散射测量机的一个例子是Nicomp 380亚微米粒度分析仪（来自粒度分析 仪公司(Particle Sizing Systems))。
[0022] 可用颗粒计数器，例如Accusizer?770(来自粒度分析公司）测定尺寸>1. 2 μΜ的 颗粒数。
[0023] 本发明的方法用于制备水包油乳液。这些乳液包含三种核心成分：油；水性组分； 和表面活性剂。
[0024] 由于乳液要用于药物学应用，油通常应该是可生物降解的（可代谢的）和生物相 容的。
[0025] 所用油可包含角鲨烯，其是一种支链不饱和萜类鲨鱼肝油（C3CIH5tl;[(CH 3)2C[= CHCH2CH2C(CH3)]2= CHCH2-]2;2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲基-2, 6, 10, 14, 18, 22-二十四碳己 烯；CAS RN 7683-64-9)。鲨烯特别优选用于本发明。
[0026] 本发明的油可包括油的混合物（或组合）例如包含角鲨烯和至少一种其他油。
[0027] 不（或除了）使用鲨烯，乳液可含有来自例如动物（如鱼）或植物来源的油。植 物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的 示例。也可使用获自（例如）霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽 油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕 麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制 备甘油和1，2_丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是种籽油中天然产生的。来自哺乳动物乳 汁的脂肪和油可代谢并因而可以使用。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它 方法的过程为本领域熟知。
[0028] 大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸 油是本文可用的几种鱼油示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总 称为萜类。也可采用鲨稀的饱和类似物鲨烧。包括角鲨稀和角鲨烧在内的鱼油，易于从商 业来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。
[0029] 其他有用的油为生育酚，特别是和角鲨烯结合。当乳液的油相包含生育酚时，可采 用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酷中的任何一种，但优选α -生育酷。可同时采用D-α -生 育酚和DL-a-生育酚。优选的a生育酚是DL-a生育酚。生育酚可取多种形式，例如不 同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。如果采用这种生 育酚的盐，那么优选的盐是琥珀酸盐。可使用包括角鲨烯和生育酚（如DL-a-生育酚）的 油组合。
[0030] 所述水性组分可为淡水（如w. f. i.)或可包括其他组分如溶质。例如，可包含盐 以形成缓冲液，例如柠檬酸或磷酸盐，例如钠盐。常用缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓 冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸缓冲剂。包含的缓冲剂一 般是 5-20mM。
[0031] 表面活性剂优选是可生物降解（可代谢）和生物相容性的。可通过' HLB'（亲水 /亲脂平衡）对表面活性剂分类，其中1-10范围内的HLB -般表示表面活性剂相比水更易 于溶于油，而10-20范围内的HLB更易溶于水而不是油。乳液优选包含至少一种HLB为至 少10,例如至少15或优选至少16的表面活性剂。
[0032] 可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表 面活性剂（通常称为吐温），特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名DOWF AXtm出售的 环氧乙烷（EO)、环氧丙烷（PO)和/或环氧丁烷（BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物； 重复的乙氧基（氧-1，2-乙二基）数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲 通（Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇） ；（辛基苯氧基）聚乙氧基乙醇（IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂如磷脂酰胆碱（卵磷脂）；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油 醇的聚氧乙烯脂肪醚（称为苄泽表面活性剂），如三乙二醇单月桂基醚（苄泽30);聚氧乙 烯-9-月桂醚以及去水山梨糖醇酯（通常称为司盘），如去水山梨糖醇三油酸酯（司盘85) 和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选表面活性剂是聚山梨酯80(吐温80 ;聚氧 乙烯去水山梨糖醇单油酸酯）、司盘85 (去水山梨糖醇三油酸酯）、卵磷脂和曲通X100。
[0033] 所述乳液中可包括这些表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物或吐温 80/曲通-XlOO混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯（吐 温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇（曲通X-100)的组合也适用。另一种 有用的组合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。有用的混合 物可包括HLB值为10-20的表面活性剂（如吐温80, HLB为15. 0)和HLB值为1-10的表面 活性剂（如司盘85, HLB为1. 8)。
[0034] 第一乳液的形成
[0035] 微流化步骤前，混合乳液组分形成第一乳液。
[0036] 第一乳液中油滴的平均尺寸可以是5000nm或以下，例如4000nm或以下，3000nm 或以下，2000nm或以下，1200nm或以下，1000 nm或以下，例如平均尺寸为800-1200nm或 300nm-800nm〇
[0037] 在第一乳液中，尺寸>1.2 μΜ的油滴数可以是5x IO1Vml或更少，例如5x IOicVml 或更少，或5x 109/ml或更少。
[0038] 然后，微流化第一乳液形成平均油滴尺寸比第一乳液更小和/或尺寸>1. 2 μΜ的 油滴更少的第二乳液。
[0039] 可通过将第一乳液组分在匀浆器中混合得到第一乳液的平均油滴尺寸。例如如 图1所示，可将其在混合容器（12)中合并，然后将混合组分引入（13)机械匀浆器，例如转 子-定子