性单体N-乙烯-2-吡咯烷（NVP)接枝到膜表面。其它的这种方法见参考文献20-26。
[0105] 在不依赖于涂层的方法中，PES可溶于溶剂，与可溶性亲水添加剂混合，然后用混 合溶液成型亲水膜，例如通过沉淀或引发共聚。这种方法见参考文献27-33。例如，参考文 献33公开了一种制备亲水带电改性膜的方法，该膜可提取物少，能够快速恢复超纯水电阻 率，具有形成的交联互穿聚合物网络结构，通过混合PES、PVP、聚乙二亚胺和脂族二缩水甘 油醚制备聚合物溶液，形成溶液薄膜，并沉淀薄膜形成膜。类似的方法公开于文献参考34。
[0106] 可使用杂交方法，其中亲水添加剂在膜形成过程中存在且稍后还作为涂层添加， 例如见参考文献35。
[0107] 也可通过低温等离子体处理实现PES膜的亲水化。参考文献36描述了通过低温 CO2等离子体处理来亲水改性PES膜。
[0108] 还可通过氧化如参考文献37所述实现PES膜的亲水化。该方法涉及用具有低表 面张力的液体预润湿疏水PES膜，使润湿的PES膜接触氧化剂水溶液，然后加热。
[0109] 还可使用相转化法，如参考文献38所述。
[0110] 可通过用PVP (亲水性）处理PES (疏水性）获得理想的亲水PES膜。发现用PEG (亲 水性）代替PVP处理得到容易积垢的亲水PES膜（特别是在用含鲨烯的乳液时），而且在高 压灭菌时不利地释放甲醛。
[0111] 优选双层滤膜具有第一亲水PES膜和第二亲水PES膜。当过滤首先通过双层醋 酸纤维素滤膜，然后通过第二双层醋酸纤维素滤膜，其中第一滤膜的较小孔径大于第二滤 膜的较大孔，而第二双层滤膜实现过滤除菌时，这种实施方式不是优选的（有时应当被排 除）。
[0112] 已知的亲水膜包括Bioassure (来自坤诺公司（Cuno)) ;EverLUX?聚醚砜； STyLUX?聚醚砜（都来自迈斯纳公司（Meissner)) ;Millex GV，Millex HP，Millipak 60，Millipak 200和 Durapore CVGL01TP3 膜（来自密理博（Millipore)) ;Fluorodyne? EX EDF 膜，Supor? EAV;Supor? EBV，Supor? EKV(都来自颇尔公司（Pall)) ;Sartopore?(来 自赛多利斯（Sartorius)) ;Sterlitech 的亲水 PES 膜；和 Wolftechnik 的 WFPES PES 膜。
[0113] 过滤过程中，乳液可维持在40°C或以下的温度，例如30°C或以下，以促进无菌过 滤成功。一些乳液可能在温度高于40°C时不能通过无菌滤器。
[0114] 优选在产生第二乳液的24小时内，例如在18小时内，12小时内，6小时内，2小时 内，30分钟内进行过滤步骤，因为这段时间以后可能第二乳液不能通过无菌滤器而同时不 对其造成堵塞，如参考文献39中所述。
[0115] 本发明的方法可大规模使用。因此，该方法涉及过滤，其体积大于1升，例如>5升， >10 升，>20 升，>50 升，>100 升，>250 升等。
[0116] 最终乳液
[0117] 微流化和过滤的结果是水包油乳液，其中油滴的平均尺寸为220nm以下，例如 155±20nm, 155±10nm或155±5nm,其中尺寸〉L 2μΜ的油滴数目可以为5xl08/ml或以下， 例如5x 107/ml或以下，5x 106/ml或以下，2x 106/ml或以下，或5x 105/ml或以下。
[0118] 本文所述的乳液的平均油滴尺寸（包括第一和第二乳液）通常不小于50nm。
[0119] 本发明的方法可大规模使用。因此，该方法涉及制备最终乳液，其体积大于1升， 例如>5升，>10升，>20升，>50升，>100升，>250升等。
[0120] 一旦形成水包油乳液，可转移到无菌玻璃瓶内。玻璃瓶的大小可以是5、8、或10 升。或者，水包油可以转移到无菌柔性袋（柔性袋）内。柔性袋的大小可以是50、100、或 250升。另外，柔性袋可接上一个或多个无菌接头，将柔性袋与系统连接。使用装有无菌接 头的柔性袋与玻璃瓶相比是有利的，因为柔性袋比玻璃瓶更大，意味着不需要更换柔性袋 来储藏一批中制备的全部乳液。这可为乳液制备提供无菌的密闭系统，从而减少了最终乳 液中杂质存在的几率。如果最终乳液用于药物学目的，例如若最终乳液是MF59佐剂，这就 特别重要。
[0121] 最终乳液中油的含量（体积％ )优选为2-20 %，例如约10 %。约5 %或约10 %的 角鲨烯含量特别有用。30-50mg/ml的鲨烯含量（w/v)是有用的，例如35-45mg/ml，36-42mg/ ml, 38_40mg/ml 等。
[0122] 最终乳液中表面活性剂的优选量（重量％ )为：聚氧乙烯山梨醇酯（例如吐 温80)0. 02-2%，特别是约0.5%或1% ;去水山梨醇酯（例如司盘85)0. 02-2%，特别是 约0.5 %或1% ;辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇（例如曲通X 100)0. 001-0. 1 %，特别是 0.005-0. 02%;聚氧乙烯醚（例如月桂醇聚醚9)0. 1-20%，优选0. 1-10%，特别是0. 1-1% 或约0.5%。4-6mg/ml的聚山梨醇醋80含量（w/v)是有用的，例如4. l-5.3mg/ml。4-6mg/ ml的去水山梨糖醇三油酸酯含量（w/v)是有用的，例如4. 1-5. 3mg/ml。
[0123] 该方法特定用于制备任何下列水包油乳液：
[0124] ?含有鲨烯、聚山梨酯80 (吐温80)和去水山梨糖醇三油酸酯（司盘85)的乳液。 该乳液的体积组成可以是约5%角鲨烯、约0. 5%聚山梨酯80和约0. 5%去水山梨糖醇三油 酸酯。以重量计，这些含量变为4. 3%鲨烯、0. 5%聚山梨酯80和0. 48%去水山梨糖醇三油 酸醋。这种佐剂称为'MF59'。MF59乳液宜包含梓檬酸根离子，如IOmM梓檬酸钠缓冲液。
[0125] ?包含鲨烯、α-生育酚（理想的是DL-α-生育酚）和聚山梨酯80的乳液。这些 乳液可含有（重量计）2-10%鲨烯，2-10% α生育酚和0.3-3%聚山梨酯80,例如4.3%鲨 烯、4.7% α-生育酚、1.9%聚山梨酯80。鲨烯：生育酚的重量比优选〈1(例如0.90)，因为 这提供了更稳定的乳液。鲨烯和聚山梨酯80的体积比可以约为5:2,或者重量比约为11:5。 可通过以下方法制备一种这类乳液：将聚山梨酯80溶解于PBS产生2%溶液，然后将90ml 该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。得到 的乳液可含有如尺寸为100_250nm，优选约180nm的亚微米油滴。
[0126] ?鲨烯、生育酚和曲通去污剂（如曲通X-100)的乳液。所述乳液还可包含3-0-去 酰基单磷酰脂质A( '3d MPL'），虽然含3d MPL的乳液在本发明中不是优选的（有时要被 排除）。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。
[0127] ?含有鲨烯、聚山梨酯（如聚山梨酯80)、曲通去污剂（如曲通X100)和生育酚 (如琥珀酸α-生育酚）的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10(如 750 μ g/ml聚山梨酯80、110 μ g/ml曲通X-100和100 μ g/ml琥珀酸α -生育酚），这些浓度 应包括抗原中这些组分的贡献。该乳液也可包含3d-MPL。该乳液也可包含皂苷，如QS21。 所述水相可包含磷酸盐缓冲液。
[0128] ?含有鲨烯、水溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂（如聚氧乙烯 (12)十六十八醚）和疏水性非离子型表面活性剂（如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如 去水山梨糖醇单油酸酯或'司盘80'）的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90% 油滴（以体积计）的尺寸小于200nm[40]。该乳液也可含有以下一种或多种物质：糖醇；低 温保护剂（例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖）；和/或烷基聚糖苷。也可包含TLR4 激动剂，如化学结构不含糖环的TLR4激动剂[41]。这类乳液可冻干。
[0129] 如上以百分数表达的这些乳液组成的稀释度或浓度可改变（例如以整数形式如2 或3倍，或以分数形式例如2/3或3/4)，其中其比例保持不变。例如，2倍浓缩的MF59可包 含约10%鲨稀，约1%聚山梨酯80和约1%去水山梨糖醇三油酸酯。可对浓缩形式进行稀 释（例如用抗原溶液），得到所需的终浓度乳液。
[0130] 本发明的乳液理想地储存在2_8°C之间。其不应冷冻。理想地，其应避直射光保 存。具体地，本发明含鲨烯的乳液和疫苗应当受到保护避免鲨烯的光化学分解。如果储存 本发明的乳液，则优选在惰性气体，例如氮气或氩气中储存。
[0131] 疫苗
[0132] 虽然可能将水包油乳液佐剂本身给予患者（如为单独给予患者的抗原提供佐剂 效应），但更常见的是在给药前将佐剂与抗原混合后形成免疫原性组合物，例如疫苗。可以 在临用前或者在疫苗生产过程中混合乳液和抗原。本发明的方法可用于这两种情况。
[0133] 因此，本发明方法可包括将乳液与抗原组分混合的加工步骤。或者，还可包括另一 将佐剂与抗原组分一起包装到药盒中形成药盒组件的步骤。
[0134] 因此，综上所述，制备混合的疫苗时或制备包含易混合的抗原和佐剂的药盒时，可 使用本发明。如果在生产过程中混合，那么所混合的散装抗原和乳液的体积一般大于1升， 例如>5升、>10升、>20升、>50升等。如果在使用时混合，那么所混合的体积一般小于1毫 升，例如〈0. 6ml、〈0. 5ml、〈0. 4ml、〈0. 3ml、〈0. 2ml等。在这两种情况下，通常所混合的乳液 和抗原溶液的体积基本相等，即基本上为1:1 (例如I. 1:1-1:1. 1，优选1.05:1-1:1.05,更 优选1.025:1-1:1. 025)。然而，在一些实施方式中，可采用过量的乳液或过量的抗原[42]。 当使用过量体积的一种组分时，过量通常为至少1. 5:1，例如>2:1、>2. 5:1、>3:1、>4:1、 >5:1 等。
[0135] 抗原和佐剂包装为药盒中的单独组分时，它们在药盒中物理上相互分离，这种分 离可通过多种方式实现。例如，组分可以装在不同的容器，如药瓶中。需要时，可通过（例 如）取出一个药瓶的内容物并将其加入另一个药瓶，或者分别取出两个药瓶的内容物并在 第三个容器中将它们混合在一起，来混合两个药瓶的内容物。
[0136] 在一种配置中，药盒的一种组分在注射器中，另一种组分在容器如药瓶中。可使用 该注射器（例如装有针头的注射器）将其内含物注入小瓶中混合，然后将该混合物抽回注 射器中。然后，一般通过新的无菌针头将该注射器中的混合成分给予患者。将一种组分包 装到注射器中无需用单独注射器对患者给药。
[0137] 在另一优选配置中，这两种药盒组分一起保存在同一注射器，例如双室注射器 (如参考文献43-50等所述）中但各自分开。当注射器运作时（例如给予患者期间），将这 两室中的内容物混合。这种配置在使用时无需单独的混合步骤。
[0138] 不同药盒组件的内容物通常均为液体形式。在一些配置中，组分（一般是抗原组 分而非乳液组分）是干燥形式（例如冻干形式），而另一组分是液体形式。可将这两种组分 混合，以再次激活干燥组分，得到给予患者的液体组合物。冻干组分一般装在