一种动物疫苗用复合佐剂及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及疫苗佐剂，具体地说，涉及一种动物疫苗用复合佐剂。
【背景技术】
[0002] 佐剂是指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变 免疫反应类型的物质。佐剂对疫苗起着至关重要的作用，它能同时对抗原和机体起作用，适 当运用佐剂可以调节甚至改变机体免疫系统产生抗原特异性的体液和/或细胞免疫应答的 类型。对于机体而言，佐剂是外源性物质，除了所需要的免疫刺激作用外，佐剂还易引起不 良反应。将佐剂加入疫苗制剂中以增强疫苗免疫原性的裨益必须与其引起不良反应的危险 性进行权衡。局部不良反应有炎症、结节、脓肿等，全身不良反应有过敏、发热、免疫抑制，甚 至有致畸、致癌、致突变等危险。随着免疫技术研究的发展，人们意识到选择合适的佐剂成 为增强免疫效果的关键，单独使用抗原或仅应用某一种佐剂，对改善抗原的反应强度、免疫 维持时间、免疫耐受等作用有限，而使用复合佐剂的疫苗往往比使用单一佐剂的疫苗，可以 诱导更强的免疫反应，因此，将不同类型佐剂配合制备出复合免疫佐剂成为佐剂发展的新 趋势。
[0003] CN1108575公开了含有抗原物质和两种佐剂混合物的疫苗，其中的一种佐剂为油 基，而另一种佐剂为水基。其中，所说的油是动物油，植物油或合成油。该技术方案由于权利 所要求的抗原物质衍生于鱼的病原体，制备的佐剂所应用的疫苗有一定的局限，且仅采用 油包水剂型，而使得体系粘度较大，免疫应答较慢，易导致免疫失败及较大的副反应等不良 后果。
[0004] CN101123982公开了适合用作包含抗原的疫苗的药物制剂，所述疫苗用佐剂配制， 所述佐剂包含在用于一氧化二氮气体的药物可接受的载体溶剂中配制的该气体的溶液且 包含至少一种脂肪酸或其酯或其他合适的衍生物，所述脂肪酸或其酯或衍生物选自油酸、 亚油酸、α-亚麻酸、γ -亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸[C20 : 5 ω 3]、二十二碳六烯酸 [C22:6co 3]、蓖麻油酸及其衍生物，所述衍生物选自其Cl至C6烷基酯、其甘油-聚乙二醇酯 和主要由基于蓖麻油酸的油组成的氢化天然油例如蓖麻油与环氧乙烷的反应产物。所述长 链脂肪酸在脂肪酸中具有14至22个碳原子，包括天然或合成来源的油以及包括植物油和动 物油。该技术方案中动植物油仅是针对应用为一氧化二氮气体药物的载体溶剂，所应用的 动植物油成分限定脂肪酸的长度为14至22个碳原子，而使得动植物油在该发明中免疫佐剂 效果未能显著体现。
[0005] CN101428145公开了一种纳米微粒佐剂、其制备方法和其在制备灭活疫苗中的应 用。发明中使用动植物油代替矿物油，所述动植物油选自棉籽油、花生油、杏仁油或角鲨烯。 该技术公开的是一种纳米乳佐剂，粒径在10~200nm之间，在制备过程中疫苗需经历高压均 质纳米处理过程，容易导致抗原效价降低甚至失活，且其仅在发明书中提及可应用动植物 油，未提供动植物油佐剂的实验实例，而使得针对动植物油佐剂的制备具有较高的难度。
[0006] 上述专利均未采用植物油和聚合物及免疫增强剂等组分复配方式来制备动物疫 苗佐剂。为达到上述组分免疫增强的协同作用，亟需一种植物油与聚合物及免疫增强剂进 行复合配伍，安全高效的动物疫苗佐剂。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种可有效避免副反应， 安全高效的动物用复合佐剂。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0009] 第一方面，本发明提供一种动物疫苗的复合佐剂，按重量份计，包括如下组分： [0010] 注射用植物油10~70份，乳化剂0· 1~20份，助剂1~10份，聚合物0.01~10份，免 疫增强剂〇.〇1~5份；
[0011]所述聚合物选自天然聚合物和/或合成聚合物。
[0012] 所采用的注射用植物油是指可从植物或植物产品中获得的油，包括可从种子、果 实、根、花、茎等获得的油。包括花生油、玉米油、向日葵油、芝麻油、芥子油、橄榄油、椰子油、 红花油、大豆油、菜籽油等，或者其组分源自植物油产品。也可以是一种或多种植物油的混 合物。在植物油中加入特定的乳化剂，可与抗原形成不同剂型的乳液，本发明所述剂型包括 但不限于油包水，水包油，水包油包水等，所述乳化剂包括多元糖的脂肪酸酯，如山梨醇，麦 芽糖醇，木糖醇，蔗糖等，以及烷基糖苷，聚甘油脂肪酸酯，磷脂类中的一种或多种的混合物 多种等。所述脂肪酸酯中脂肪酸选自硬脂酸、异硬脂酸、软脂酸、油酸、亚油酸、月桂酸、蓖麻 醇酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、乙酸，酒石酸等。在本发明的内容中，优选山梨醇单油酸酯、山梨醇 单月桂酸酯、脱水山梨醇油酸酯及蔗糖油酸酯，烷基糖苷，聚甘油脂肪酸酯，卵磷脂。同时为 提高乳化剂的乳化效果，可加入小分子的醇或酸，如丙二醇，丙三醇，硬脂酸等。
[0013] 本发明所述的聚合物包括两大类:①天然聚合物，如蜂胶、淀粉、木质素、果胶、明 胶、纤维素、甘露聚糖、白蛋白、甲壳素、环糊精等。②合成聚合物，包括化学合成和生物合 成，如含乙烯亚胺，乳酸，丙烯酸，己内酯，乙二醇，丙三醇，丙内酯等单体的聚合物，聚酯聚 羟基丁酸酯(PHB)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乳酸、聚丙交酯、聚氧乙烯聚氧丙烯醚、聚 乳酸-羟乙酸(PLGA)、聚丙交酯乙交酯(PLCG)、聚谷氨酸、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚己内 酯、聚羟丁酸、聚甘油、聚甲基丙烯酸甲酯，聚交联丙烯酸酯，聚乙二醇交酯酸共聚物等。天 然聚合物可以通过改性处理，合成聚合物可通过改变单体比例及聚合条件等措施，另外也 可通过化学修饰基团或者生物活性基团修饰对聚合物进行处理，来调节聚合物对抗原的吸 附、包裹的状况以及在体内的降解速度，从而来调节聚合物的免疫增强效果。
[0014] 同时为增强植物油和聚合物佐剂的免疫佐剂作用，可加入细菌性免疫增强剂如短 小棒状杆菌，卡介苗，大肠杆菌不耐热肠毒素，海藻糖二霉菌酸脂，牛布鲁氏菌制剂等;也可 加入生化药物类，例如氯(溴)化双十八烷基二甲基铵、西咪替丁、环二鸟苷酸、聚肌苷酸-聚 胞苷酸、吡喃、白介素-2、梯洛龙、左旋咪唑、丙胺肌苷、氮丙啶类、异丙肌苷、青霉素胺类等； 也可以加入中草药类:包括党参、黄芪、西红花、绞股蓝、地黄、紫锥菊、当归等及其提取物。
[0015] 作为优选，本发明所述的复合佐剂，按重量份计，包括如下组分： 注射用植物油 10 ~ 50份 乳化剂 1 ~ 12份
[0016] 助剂 1 ~ 10份 聚合物 0.1~10份 免疫增强剂 0.01~5份"
[0017] 进一步地，所述聚合物优选为环糊精、甘露聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷 酮、聚乳酸-羟乙酸(PLGA)、聚交联丙烯酸酯、聚乙二醇和聚甘油中的一种或几种。
[0018] 所述乳化剂选自山梨醇脂肪酸酯、蔗糖酯、丙二醇脂肪酸酯、乙二醇脂肪酸酯、癸 基葡糖苷、椰油基葡糖苷、月桂基葡糖苷等糖苷、甘油脂肪酸酯或聚甘油脂肪酸酯等非离子 乳化剂中的一种或几种，优选为聚甘油脂肪酸酯，糖苷，山梨醇脂肪酸酯中的一种或几种。
[0019] 所述助剂为碳链长度为3~22的直链或有支链的脂肪酸或脂肪醇。
[0020] 所述脂肪酸选自硬脂酸、异硬脂酸、软脂酸、油酸、亚油酸、月桂酸、蓖麻醇酸、棕榈 酸、肉豆蔻酸、琥珀酸中的一种或多种。
[0021] 所述脂肪醇选自丙二醇，丙三醇，正辛醇，正壬醇，正癸醇，十一烷醇，十二烷醇（月 桂醇），十四烷醇(鲸蜡醇），十八烷醇(硬脂醇），二十烷醇(花生醇），二十二醇中的一种或几 种的混合物。
[0022] 作为优选，所述助剂选自丙二醇、丙三醇、硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂醇、十四 烷醇或十八烷醇中的一种或几种，优选为硬脂酸，丙二醇，丙三醇、月桂醇中的一种或几种。
[0023] 第二方面，本发明提供了所述复合佐剂的制备方法，包括如下步骤：
[0024] 1)将乳化剂和助剂，加入到注射用植物油中，物理混合得到乳液；
[0025] 2)将聚合物制备成浓度为0.05~50%的水溶液，加入步骤1)制备的乳液中，混合 均匀；
[0026] 3)向步骤2)所得中加入细胞或生化药物类免疫增强剂，制得复合制剂。
[0027] 其中，所述步骤2)中，将聚合物水溶液灭菌冷却后加入步骤1)制备的乳液中，搅拌 混合均勾，控制搅拌速度至3000转/分以下。
[0028]其中，所述步骤1)中，物理混合过程中可进行加热，温度控制在40~80°C。
[0029] 第三方面，本发明提供了一种动物疫苗，其含有本发明前述的复合佐剂。
[0030] 进一步地，本发明为所述动物疫苗提供一种优选的制备方法，具体为，将动物疫苗 水相抗原缓慢加入到所述复合佐剂中，进行剪切乳化，控制剪切速度在5000转/分以下，剪 切乳化10分钟以内，即得。
[0031]本发明同时提供了上述动物疫苗的制备方法，所述方法优选包括如下步骤：（本发