人sDR5-Fc抗体融合蛋白作为肾损伤治疗药物的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于医药领域，具体涉及人sDR5(soluble death receptor 5，sDR5)蛋白的药用用途，尤其是人sDR5-Fc抗体融合蛋白作为肾缺血再灌损伤急救和治疗药物的应用。
【背景技术】
[0002]缺血再灌注损伤是指器官或组织的供血中断或减少，造成局部组织或器官缺血缺氧，再灌注后不仅不能使组织器官的功能得以恢复，反而使其缺血缺氧所致的功能和代谢障碍及机构破坏进一步加重的现象。临床上缺血再灌注损伤常见于器官移植、器官部分摘除、创伤及休克等，肾脏由于其血流高灌注的特性，缺血再灌注损伤发生率较高。
[0003]瞬间的缺血能够造成肾脏发生可逆性的损伤，而长期的缺血再灌注可以造成肾脏近曲小管远端发生不可逆的损伤。肾脏缺血再灌注损伤是临床上常见的急性肾损伤(acutekidney injury，AKI)，是导致急性肾衰竭和移植肾功能丧失的主要原因之一，AKI在普通人群中的发病率约为0.5-1%，在住院患者中其发病率为5%，而在一些手术后及重症加强护理病房患者中其发病率为30-50%;除了较高的发病率，AKI患者还会有很高的死亡率，约为28-90%，约为相同病情未发生AKI患者死亡率的5倍，且存活的患者亦多有不同程度的慢性肾功能不全，特别是在肾脏移植中，肾脏缺血再灌注损伤是影响移植肾脏早起存活的重要因素，可导致移植肾脏短期和长期功能损害，包括移植肾脏原发性无功能、移植肾急性排斥反应、慢性移植肾失功等。对此，目前尚无特殊有效的治疗手段，严重的病例需终身肾脏替代治疗。因此，如何避免肾脏发生缺血再灌注损伤，具有重要的临床意义。
[0004]细胞对缺血缺氧、炎症介质等损害因素的应答本质上是一种应激反应，细胞应该是细胞功能受损甚至死亡的重要原因之一。在肾脏缺血再灌注损伤中，肾小管上皮细胞存在三种结局:细胞可逆性损伤、细胞坏死和细胞凋亡。随着急性肾衰竭诊断和治疗水平的提高，肾脏缺血与再灌注的间隔时间较以往明显缩短，肾小管上皮细胞坏死在很大程度减轻，因此在目前多数情况下，肾小管上皮细胞凋亡在肾脏缺血再灌注损伤中占主导作用。
[0005]死亡受体5(Death receptor，DR5)与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF —related apoptosis-1nducing ligand, TRAIL)结合所激活的死亡受体通路，可通过招募相关蛋白形成DISC(death_inducing signaling complex)，进而级联式活化Caspase_8、3等，引起细胞凋亡。全长的DR5是含有411个氨基酸的I型跨膜糖蛋白。可溶性死亡受体5(soluble DR5，sDR5)因缺乏跨膜区域不能在细胞膜上表达而被分泌至细胞外。sDR5在正常人外周血中表达较低，因其具有与TRAIL配体相结合的胞外段完整结构，可与细胞膜上的死亡受体竞争性结合TRAIL分子，从而阻断TRAIL诱导的细胞凋亡。
[0006]有研究表明:sDR5可通过阻断TRAIL诱导的细胞凋亡来减轻乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的肝细胞损伤(参见:Yu-Gang Liu , Su-Xia Liu , Xiao-Hong Liang et al.Blockade of TRAIL pathway amel1rates HBV-1nduced hepatocyte apoptosis in anacute hepatitis model.B1chemical and B1physical Research Communicat1ns352 (2007) 329-334)及改善因缺血造成的中枢系统损伤(参见:Min Cui，Limei Wang，Xiaohong Liang et al.Blocking TRAIL-DR5 signaling with soluble DR5 reducesdelayed neuronal damage after transient global cerebral ischemia.Neurob1logy of Disease 39 (2010) 138-147)。目前，sDR5对于同样因缺血引起的肾组织损伤是否存在治疗作用，国内外尚无报道。
[0007]肾缺血及血运重建后再灌注损伤的发生与肾小管上皮细胞的过度凋亡密切相关，针对凋亡发生的信号转导通路，利用sDR5-Fc与膜型DR5竞争结合TRAIL，使TRAIL不能启动凋亡程序的发生，这样可减少肾组织损伤，改善患者长期预后。
【发明内容】
[0008]本发明目的在于研究人sDR5-Fc抗体融合蛋白通过阻断/封闭TRAIL-死亡受体通路来减少肾小管上皮细胞凋亡的作用，并进一步提供人sDR5-Fc融合蛋白作为肾损伤治疗药物的应用。
[0009]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
人sDR5-Fc抗体融合蛋白作为肾损伤治疗药物的应用，如，可以是作为急性肾损伤或肾缺血-再灌注损伤治疗药物的应用，也可以是作为急性肾功能衰竭或肾移植排斥治疗药物的应用。
[0010]人SDR5-FC抗体融合蛋白在制备阻断TRAIL诱导的细胞凋亡药物中的应用。所述人sDR5-Fc抗体融合蛋白通过阻断TRAIL/DR5通路诱导的细胞凋亡，来减少肾组织损伤，以达到保护肾脏细胞的作用。
[0011]人sDR5_Fc抗体融合蛋白的蛋白序列、序列修饰及相关生物工程产品在制备治疗肾缺血-再灌注损伤药物中的应用。
[0012]人sDR5-Fc抗体融合蛋白与其它药物在肾缺血-再灌注损伤中的协同治疗应用。
[0013]本发明利用哺乳动物细胞CHO细胞来源的人sDR5-Fc抗体融合蛋白，在C57BL/6小鼠肾缺血再灌注模型中测试了人sDR5-Fc抗体融合对肾缺血-再灌注损伤的保护作用，分别获得人sDR5-Fc抗体融合能够减少肾缺血再灌注损伤程度、降低肾小管上皮细胞凋亡率，改善肾功能的结果。实验结果显示:在双侧肾缺血22分钟再灌注24小时模型中，再灌注2h/6h时，按照15.0 mg/kg的剂量，通过单次腹腔注射sDR5-Fc抗体融合蛋白，用药组与对照组相比均可明显减少肾缺血再灌注损伤程度。另外，人sDR5-Fc抗体融合蛋白可明显降低缺血模型中肾小管上皮细胞凋亡率。
[0014]本发明通过动物实验证实:人sDR5-Fc抗体融合蛋白能阻断TRAIL/DR5通路诱导的细胞凋亡，减少肾缺血再灌注损伤程度，达到保护肾脏的作用，对肾缺血和再灌注损伤有治疗作用，作为新型候选药物极具开发潜力和临床应用前景。
[00?5]为了更好地理解本发明的实质及本发明所述人sDR5_Fc抗体融合蛋白的作用效果，以下将通过具体的附图和实施例对本发明在制备治疗肾缺血再灌注损伤的药物中的应用进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了理解和说明，本领域的技术人员或其他人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对其做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
【附图说明】
[0016]图1纯化的人sDR5_Fc蛋白纯化前后考马斯亮蓝染色；
图2纯化的人sDR5-Fc蛋白对TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡的阻断效应;200 ng TRAIL单独或与500 ng人sDR5-Fc蛋白同时加入5 X 16 Jurkat细胞，24小时后流式细胞术检测细胞凋亡，加入培养基组作为对照；
图3小鼠双侧肾缺血22分钟再灌2h给药模型各组肾功能检测结果;A:尿素氮检测结果;B:血肌酐检测结果
图4小鼠双侧肾缺血22分钟再灌2h给药模型各组肾脏组织HE染色结果；
图5小鼠双侧肾缺血22分钟再灌2h给药模型肾脏组织免疫组化DR5检测结果；
图6小鼠双侧肾缺血22分钟再灌2h给药模型肾脏组织免疫组化TRAIL检测结果；
图7小鼠双侧肾缺血22分钟再灌2h给药模型肾脏组织免疫组化Caspase-3检测结果；图8小鼠双侧肾缺血22分钟再灌2h给药模型肾脏组织免疫组化Caspase-8检测结果；图9小鼠双侧肾缺血22分钟再灌6h给药模型各组肾功能检测结果;A:尿素氮检测结果;B:血肌酐检测结果；
图10小鼠双侧肾缺血22分钟再灌6h给药模型各组肾脏组织HE染色结果；
图11小鼠双侧肾缺血22分钟再灌6h给药模型肾脏组织免疫组化DR5检测结果；
图12小鼠双侧肾缺血22分钟再灌6h给药模型肾脏组织免疫组化TRAIL检测结果；
图13小鼠双侧肾缺血22分钟再灌6h给药模型肾脏组织免疫组化Caspase-3检测结果； 图14小鼠双侧肾缺血22分钟再灌6h给药模型肾脏组织免疫组化Caspase-8检测结果； 图15小鼠双侧肾缺血22分钟再灌6h给药模型肾脏组织免疫组化TUNEL检测结果。
【具体实施方式】
[0017]以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
[0018]实施例1:人sDR5_Fc抗体融合蛋白的制备
将 DR5 胞外段基因序列(182 个氨基酸，http: //www.uniprot.0rg/uniprot/014763)克隆入带人IgG Fe段的真核表达载体pGS-Fc中，设计引物为:sense(5’-3’):ggaagcttgccaccATG GAA CAA CGG GGA CAG，antisense(5’_3’): aagaattcTCT GGT CGTGGT GCA GGG。提取高纯度质粒(OMEGA Plasmid Midi Kit)并调整浓度为500 ng/μ?。复苏CH0/KI细胞，调整细胞状态至最佳，瞬时电转(300v，间隔时间0.125s，持续时间0.1ms，电击三次)，经MSX加压筛选得到高表达稳定细胞株。目前本发明融合蛋白产量可达到1.9g/L。用纯化后的蛋白进行体外功能验证，检测其是否可以阻断TRAIL诱导的人白血病细胞系Jurkat细胞凋亡。
[0019]图1显示该抗体融合蛋白sDR5_Fc纯度以及大小，说明该融合蛋白大小45kd，纯度大于90%。
[0020]图2显示人sDR5_Fc在Jurkat细胞中凋亡信号阻断效应。流式结果显示:当同时加入TRAIL和sDR5-Fc后，细胞凋亡情况与正常不作处理组(图中以Normal表示)类似，而只加TRAIL组则细胞凋亡比较严重，因此说明sDR5-Fc具有良好的阻断效应。
[0021]实施例2:人sDR5-Fc抗体融合蛋白在肾缺血再灌损伤中保护作用肾缺血再灌注损伤小鼠动物模型的建立
清洁级6-8周龄雄性C57BL/6小鼠，称重后，腹腔注射5%水合氯醛(7.5ml/kg)麻醉，将小鼠放置恒温台上，小鼠背部去毛，暴露皮肤，待小鼠体温恢复到36°C后开始实施手术，在小鼠肋骨下方，脊柱两侧分别打开I cm左右的小口，小鼠的左肾比右肾偏低，故左肾的小口要略向下，再剪开肌肉层，用棉花棒轻轻将肾脏挤出伤口，暴露出两肾；右肾的肾蒂略短，首先用动脉夹夹住右肾，再立刻夹住左肾，左右肾夹闭时间差不超过2min，两肾的颜色由鲜红逐渐变成深红色，夹闭时间设置为22min，将两肾放