Vegfr2单链抗体与mica融合蛋白的制备方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种新的可与人血管内皮细胞生长因子受体 2特异结合的高亲和力的与MICA连接的融合抗体（AK404R-MICA)，可以抑制内皮细胞的增 殖、迀移、细胞侵袭和小管形成，还可以显著抑制肿瘤细胞K562的生长，是一种具有抗肿瘤 活性的基因工程融合抗体。
【背景技术】
[0002] 肿瘤细胞能够渗入淋巴管和血管并通过血流循环侵入正常的组织中，使癌症成为 潜在威胁生命的疾病。肿瘤细胞的转移的一个必备条件就是血管的新生。然而，新生血管 的形成的关键之一就是血管内皮细胞生长因子（VEGF)家族和相关受体，它通过与血管内 皮生长因子受体（VEGFR)结合激活细胞内信号通路，刺激血管内皮细胞增殖、迀移，促进新 生血管的生成，与机体多种常见肿瘤的发病及肿瘤的转移有着密切的关系。VEGFR-2,在人 体内又称为KDR(KinaseInsertDomainReceptor)，与VEGF具有较高的亲和力，它在介导 VEGF刺激内皮细胞增殖及血管通透性等生物学活性中起重要作用。。KDR属酪氨酸激酶受 体（Receptorprotein-tyrosinekinase)，2?3区和VEGF的结合有关，2和4区主要影响 其与VEGF的分离，1区主要负责调节受体与配体的结合，4?7区中可能存在抑制与VEGF 结合的位点，其中3区（即KDR3,含有97个氨基酸）对VEGF的结合贡献最为突出。
[0003]主要组织相容性复合物工链分子A(MajorHistocompatibilityComplexclass I-relatedchainmoleculesA，MICA)，是一种高度糖基化的由MHC基因编码的跨膜糖蛋 白，在免疫监视中起重要作用，MICA为天然杀伤（NK)细胞活化受体NKG2D的配体，研宄表 明，表达MICA的肿瘤细胞普遍对NK细胞杀伤较为敏感。自然杀伤细胞表面受体2D(NKG2D)， 是C型凝集素超家族中的一员，不仅表达于所有的NK细胞，且表达于CD8+T细胞、活化的巨 噬细胞表面。NKG2D与其配体的交联可触发NK细胞的细胞毒活性，在肿瘤免疫监视中起着 非常重要的作用，靶细胞上NKG2D配体的表达水平几乎决定了机体NK细胞免疫应答的强 弱。
[0004] 之前本实验室利用噬菌体展示技术获得了以KDR胞外3区为抗原的单链抗体 AK404R，但是考虑到单链抗体的相对较小的分子量（30KDa)并且缺失Fc片段，我们构建表 达了 一个融合抗体AK404R-MICA去增强其肿瘤治疗的有效性。
[0005] 贝伐单抗（Bevacizumab，商品名Avastin)是目前市场上最常用于针对 VEGF-VEGFR2信号通路的抗体药物。是重组的人源化单克隆抗体，2004年获得FDA的批准， 是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药。通过体内外检测系统证实IgGl抗 体能与人血管内皮生长因子（VEGF)结合并阻断其生物活性。而阿瓦斯汀包含了人源抗体 的结构区和可结合VEGF的鼠源单抗的互补决定区。
【发明内容】
[0006] 发明目的
[0007] 本发明提供一种具有潜在医学和药学价值的融合抗体AK404R-MICA。本发明的融 合抗体的特征是VEGFR2的单链抗体与MICA连接，在体外能够抑制人白血病细胞K562的增 殖。
[0008] 技术方案
[0009] -种VEGFR2的单链抗体与MICA连接融合抗体的制备，其特征在于：
[0010] VEGFR2的单链抗体与MICA连接的融合抗体包括以KDR胞外3区为抗原的单链抗 体AK404R和MICA，通过一个Linker(G4S)连接。
[0011] -种分离的核酸，其特征在于该核酸编码上述的抗体。
[0012] 一种表达载体，含有上述的核酸。
[0013] 一种重组宿主细胞，含上述的表达载体。
[0014] 一种毕赤酵母分泌表达法，用于分泌表达的融合抗体。
[0015] 上述任一项的融合抗体或融合抗体片段的应用，选择性地与KDR3结合或NKG2D结 合。
[0016] 上述任一项的融合抗体片段，选自单链抗体、Fab、单链Fv、双抗体和三抗体。
[0017] 上述任一项的融合抗体或融合抗体片段的偶联物。
[0018] 所述的偶联物，含有抗肿瘤药物、靶组成部分或报告组成部分。
[0019] 发明进一步说明：
[0020] 本发明中融合抗体基因序列全长1596个核苷酸，其中单链抗体735个核苷酸， MICA828个核苷酸，通过一个Linker(G4S)连接。
[0021] 含有本发明人血管内皮生长因子受体单链抗体基因的表达载体和宿主菌，MICA基 因的表达载体和宿主菌以及融合抗体的表达载体和宿主细胞均属于本发明的保护范围。扩 增本发明融合抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
[0022] 本发明的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述融合抗体AK404R-MICA的 方法。
[0023] 本发明通过一个G4S连接单链抗体和MICA并导入到毕赤酵母中筛选发酵得到能 特异性结合KDR3和NKG2D的融合抗体。培养5天后，低温离心去除细胞碎片，将上清过镍 亲和层析柱进行分离纯化；WesternBlot鉴定分离纯化得到的AK404R-MICA;ELISA分析融 合抗体与KDR3和NKG2D的结合作用；利用表面等离子体共振分析融合蛋白与KDR3和NKG2D 的亲和力；检验融合蛋白对人白血病细胞K562的抑制作用。
[0024] 本发明得到的融合抗体AK404R-MICA与人白血病细胞K562和人脐静脉内皮细胞 HUVEC具有高特异性结合，体外抑制肿瘤细胞生长实验结果表明，本发明得到的融合抗体可 以明显抑制肿瘤细胞的生长。本发明为治疗和诊断以人内皮血管生长因子受体的表达，特 别是过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法，相关疾病包括但不限于自身免疫病和 癌症。
【附图说明】
[0025] 图1。图1A是表达质粒的构建。LI:linkerl，L2 :linker2,限制酶切位点：EcoRl 和Xbal。图1B是MICA和AKA404R的PCR后的产物图。图1C是AK404R-MICA经PCR后的 产物图。
[0026] 图2。图2A显示SDS-PAGE蛋白质电泳图，描述发酵表达的融合抗体通过镍柱进 行分离纯化的结果，泳道1?9不同浓度咪唑缓冲液洗涤镍柱结果，泳道2?9为含lOOmM 咪唑缓冲液洗脱镍柱获得的目的蛋白（70KD)图2B显示的是融合蛋白的示意图；图2C显示 SDS-PAGE经纯化复性后的MICA，泳道1为非还原性MICA，泳道2为还原性MICA。图2D显 示SDS-PAGE经纯化复性后的NKG2D，泳道1为非还原性NKG2D，泳道2为还原性NKG2D。图 2E显示利用WesternBlot融合抗体与重组KDR3的结合。图2F显示利用WesternBlot融 合抗体与重组NKG2D的结合。
[0027] 图3。图3A展示的是等面等离子体共振分析融合抗体与重组NKG2D之间的亲和力 常数，Ka=ka= 6. 77X109/MS，kd= 267. 4/S和KD= 3. 95X1(T8M。图 3B展示的是等面等 离子体共振分析融合抗体与重组KDR3之间的亲和力常数，Ka= 4. 26X106/MS，kd= 261/S 和KD= 6. 13X10 _7M。图3C展示的是融合抗体与重组NKG2D的ELISA结合活性。图3D展 示的是融合抗体与重组KDR3的ELISA结合活性。
[0028] 图4。图4A、D流式细胞术检测融合抗体、AK404R与HUVEC细胞的结合，结合率分 别为62. 7%和67. 0%，对照组MICA和PBS分别为2. 1 %和1. 5%。图B、D流式细胞术检测 融合抗体、MICA与U937的结合，结合率分别为69. 7 %和58. 0 %，对照组AK404R和PBS与 U937无显著性结合。图C、D流式细胞术检测融合抗体、AK404R、MICA和PBS均与HEK293 (人 胚肾细胞）细胞无显著结合。
[0029] 图5。图5A展示融合抗体对HUVEC细胞的抑制作用呈现剂量和时间依赖性。 图5B展示的是融合抗体对HUVEC细胞的抑制增殖作用，48小时的半数抑制率IC5(I:? 333. 186nM，HEK293作为阴性细胞。
[0030] 图6。图6A展示是Transwell侵袭实验，融合抗体能够有效抑制内皮细胞的侵袭。 图6B定量分析Transwell侵袭实验，融合抗体能够以剂量依赖性抑制内皮细胞的侵袭。
[0031] 图7。图7A展示K562的细胞毒实验，随着效应细胞/靶细胞的比例升高而升高。图 7B展示MDA-MB-435的细胞毒实验，随着效应细胞/靶细胞的比例升高而升高。图7C展示的 B16F1细胞毒实验，随着效应细胞/靶细胞的比例升高而升高。图7D展示3T3-L1 (control) 的细胞毒实验。
[0032] 以下借助非限制性实施例举详细描述本发明。对本领域技术人员而言，在不背离 本发明精神的前提下对它所做的任何显而易见的改动，特别是对若干部件的等同替换，都 构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。
【具体实施方式】
[0033] 实施例中涉及的百分比，其中固定试剂为重量体积百分比，液体试剂为体积百分 比。
[0034] 实施例1AK404R-MICA质粒的构建和转染
[0035] 抗人血管内皮生长因子受体2的单链抗体基因用pHEN2-AKA404R(实验室保存） 扩增获得，据此设计了一对引物，上游引物P1:5'-GGAATTCGAGGTGCAGCTGGTG-3'和下游引 物P2:5'-GGITCTGAACCACCACCACCACCTAGGACGGTCAG-3'，MICA基因用pET2