专利名称：检测单链和/或双链dna的分子探针及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于材料制备技术领域，涉及一种检测单链和/或双链DNA的分子探针及其应用；具体是一种基于Ru配合物作为荧光分子探针，其应用在于其能够与单链 DNA(ssDNA)或者双链DNA(dsDNA)作用从而产生荧光信号。
背景技术：
核酸作为遗传信息的重要载体，在生物传感体系的研究应用中，核酸的检测分析一直是一项非常重要的研究内容，其中DNA的特异性识别在基因组学、疾病诊断、病毒学、 分子生物学等领域越来越得到更多的重视和研究。现有技术对双链DNA(dsDNA)的研究已经较为普遍和成熟，然而，能够检测单链DNA分子的荧光分子探针却相对较少，能够同时对单链DNA (ssDNA)和双链DNA进行简单快速、低成本、高灵敏的识别存在较大的挑战，而这些技术正是在DNA检测分析中极为重要的一环。近年来，吸光度法、荧光法、瑞丽光散射法、化学发光法以及电化学法在核酸分析中得到普遍的应用，其中因荧光法具有操作简便，高灵敏度和可见性等特点得到广泛的研究。自Barton等人在研究一系列Ru(II)多批唳类配合物与核酸相互作用时发现，其在水溶液中没有荧光，而当溶液里有dsDNA存在时有很强的荧光，因此把它们称为核酸分子“光开关”。近年核酸分子“光开关”型探针得到了广泛深入的研究，合成开发特异性的荧光探针成为DNA荧光传感策略中的关键，[Ru(bpy)2dppz]2+是DNA分子开关中最为经典的一种， 目前已知文献中，大都是对[Ru(bpy)2dppz]2+作为dsDNA探针的研究,然而，还未见利用 [Ru(bpy)2dppz]2+来检测ssDNA分子的报道。尽管关于[Ru (bpy) 2 (dppz)]2+的研究已经近20年了，其与DNA的键合机理的一直备受争议，目前较多认可的是此探针的dppz配体通过插层作用插入到双链DNA中。然而， 在2009年Barton课题组发现该探针存在的多种异构体与DNA的键合方式都存在差异，如 Δ (右手异构)型配合物容易键合B-DNA，而Λ (左手异构)型配合物容易键合Z-DNA[1]。 导致这种结果的主要原因是由于探针的空间结构不同从而使键合方式发生改变。本发明涉及的参考文献[l]Lim，Μ. H.，et al.，Sensitivity of Ru (bpy) (2) dppz (2+) Luminescence to DNA Defects. Inorganic Chemistry,2009. 48 (12) p. 5392-5397.[2] Friedman, A. E.，et al.，A molecular light switch for DNA Ru (bpy)2 (dppz)2+.Journal of the American Chemical Society,1990. 112 (12) p. 4960-4962.[3] HolmLin, R . E .，E . D . A . Stemp，and J . K . Barton， Ru (phen)2dppz2+Luminescence-Dependence on DNA Sequences and Groove-Binding Agents. Inorganic Chemistry, 1998. 37 (I) p. 29-34.[4]Wang, J. ， et al. ， Aptamer-BasedATP Assay Using a Luminescent Light Switching Complex. Analytical Chemistry,2005. 77(11) p.3542-3546.
[5] Barton, J. K. , E. D. Olmon, and P. A. Sontz, Metal complexes for DNA-mediated charge transport. Coordination Chemistry Reviews,2011. 255(7-8) p. 619-634.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是通过优化合成方法而提供一种能够检测ssDNA和/ 或dsDNA的分子探针，使得本发明的分子探针合成过程简单可控，得到的分子探针可以简单快速反映出溶液中是否存在DNA分子，且本发明最大的优点在于可直接有效检测溶液中的ssDNA和/或dsDNA，免除因使用昂贵的带有荧光标记的DNA探针而导致操作步骤繁琐， 检测成本高的问题。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下一、一种化学结构式I的分子探针(名称2，2’ -联吡啶二吡啶并[3，2_a:2’， 3’ -c]吩嗪钌，简称[Ru(bpy)2dppz]2+);其特征在于其通过合成路线II所述的方法制备而得I)化合物I的合成将邻菲哕啉与溴化钾干燥后加入到充分冷却的浓硫酸中，充分冷却后再滴加HNO3 ;将反应体系加热到40 50°C恒温2小时，再升温到80 90°C恒温 2小时，再到120°C恒温I小时，然后降温到80°C恒温一夜；冷却到室温后，中和反应体系至 pH = 6 7，减压抽滤后用CH2Cl2萃取至CH2Cl2接近无色得到化合物I粗产品。进一步地，粗产品在甲醇中重结晶，得到黄色固体纯品；进一步地，对产物pH的调节中和时先用浓NaOH溶液，后用Na2CO3溶液直至无气泡产生。2)化合物2的合成用乙醇溶解化合物I，然后滴加邻苯二胺的乙醇溶液；回流两小时得到淡黄色絮状沉淀，减压抽滤，重结晶后真空干燥得到海绵状黄色固体即化合物2。3)化合物3的合成将N，N’_ 二甲基甲酰胺加入三氯化钌和2，2’-联吡啶的混合体系，加热回流4个小时后，蒸发掉将所得溶液的大部分溶剂，剩下的溶液冷却至室温后， 再加入丙酮并保持温度0°C静置24个小时，析出棕黑色的固体不溶物即化合物3粗产品。进一步地，将化合物3粗产品减压抽滤并用蒸馏水洗涤粗产品两次；再将所得粗产品放在水与乙醇为体积比I : I的混合溶液中加热回流一个小时后过滤，再加入氯化锂充分搅拌；最后蒸发溶液中的乙醇，剩下的水溶液冷却后再继续放在冰浴中冷却；静置24 个小时后，溶液中析出黑色晶体；过滤，真空干燥得到化合物3纯品。4)化学结构式I的分子探针的合成将化合物3与化合物2按照摩尔比为1:1.1 的比例加入乙醇中，在氮气保护下加热回流直到反应溶液变为红色透明溶液为止，冷却到室温；蒸出大部分溶剂后加入水煮沸后，再放到冰水浴中冷却，析出不溶物；经过滤，洗涤， 旋蒸，重结晶，得到化学结构式I的探针分子；
权利要求
1.一种化学结构式I的分子探针，其特征在于其通过合成路线II所述的方法制备而1)化合物I的合成将邻菲啰啉与溴化钾干燥后加入到充分冷却的浓硫酸中，充分冷却后再滴加HNO3 ;将反应体系加热到40 50°C恒温2小时，再升温到80 90°C恒温2 小时，再到120°C恒温I小时，然后降温到80°C恒温一夜；冷却到室温后，中和反应体系至 pH=6 7，减压抽滤后用CH2Cl2萃取至CH2Cl2接近无色得到化合物I粗产品；2)化合物2的合成用乙醇溶解化合物1，然后滴加邻苯二胺的乙醇溶液；回流两小时得到淡黄色絮状沉淀，减压抽滤，重结晶后真空干燥得到海绵状黄色固体即化合物2 ；3)化合物3的合成将N，N’-二甲基甲酰胺加入三氯化钌和2，2’ -联吡啶的混合体系，加热回流4个小时后，蒸发掉将所得溶液的大部分溶剂，剩下的溶液冷却至室温后，再加入丙酮并保持温度0°C静置24个小时，析出棕黑色的固体不溶物即化合物3粗产品；4)化学结构式I的分子探针的合成将化合物3与化合物2按照摩尔比为I: I. I的比例加入乙醇中，在氮气保护下加热回流直到反应溶液变为红色透明溶液为止，冷却到室温；蒸出大部分溶剂后加入水煮沸后，再放到冰水浴中冷却，析出不溶物；经过滤，洗涤，旋蒸，重结晶，得到化学结构式I的探针分子；
2.根据权利要求I所述的化学结构式I的分子探针，其特征在于所述的步骤I)的粗产品在甲醇中重结晶，得到黄色固体纯品。
3.根据权利要求I所述的化学结构式I的分子探针，其特征在于所述的步骤I)对产物 pH的调节中和时先用浓NaOH溶液，后用Na2CO3溶液直至无气泡产生。
4.根据权利要求I所述的化学结构式I的分子探针，其特征在于所述的步骤3)将化合物3粗产品减压抽滤并用蒸馏水洗涤粗产品两次；再将所得粗产品放在水与乙醇为体积比1:1的混合溶液中加热回流一个小时后过滤，再加入氯化锂充分搅拌；最后蒸发溶液中的乙醇，剩下的水溶液冷却后再继续放在冰浴中冷却；静置24个小时后，溶液中析出黑色晶体；过滤，真空干燥得到化合物3纯品。
5.权利要求I所述的化学结构式I的分子探针的制备方法，其特征在于其通过合成路化合物2 II。线II所述的方法制备而得1)化合物I的合成将邻菲啰啉与溴化钾干燥后加入到充分冷却的浓硫酸中，充分冷却后再滴加HNO3 ;将反应体系加热到40 50°C恒温2小时，再升温到80 90°C恒温2 小时，再到120°C恒温I小时，然后降温到80°C恒温一夜；冷却到室温后，中和反应体系至 pH=6 7，减压抽滤后用CH2Cl2萃取至CH2Cl2接近无色得到化合物I粗产品；2)化合物2的合成用乙醇溶解化合物1，然后滴加邻苯二胺的乙醇溶液；回流两小时得到淡黄色絮状沉淀，减压抽滤，重结晶后真空干燥得到海绵状黄色固体即化合物2 ；3)化合物3的合成将N，N’-二甲基甲酰胺加入三氯化钌和2，2’ -联吡啶的混合体系，加热回流4个小时后，蒸发掉将所得溶液的大部分溶剂，剩下的溶液冷却至室温后，再加入丙酮并保持温度0°C静置24个小时，析出棕黑色的固体不溶物即化合物3粗产品；4)化学结构式I的分子探针的合成将化合物3与化合物2按照摩尔比为I: I. I的比例加入乙醇中，在氮气保护下加热回流直到反应溶液变为红色透明溶液为止，冷却到室温；蒸出大部分溶剂后加入水煮沸后，再放到冰水浴中冷却，析出不溶物；经过滤，洗涤，旋蒸，重结晶，得到化学结构式I的探针分子；
6.根据权利要求5所述的化学结构式I的分子探针的制备方法，其特征在于所述的步骤I)的粗产品在甲醇中重结晶，得到黄色固体纯品。
7.根据权利要求I所述的化学结构式I的分子探针的制备方法，其特征在于所述的步骤I)对产物pH的调节中和时先用浓NaOH溶液，后用Na2CO3溶液直至无气泡产生。
8.根据权利要求I所述的化学结构式I的分子探针的制备方法，其特征在于所述的步骤3)将化合物3粗产品减压抽滤并用蒸馏水洗涤粗产品两次；再将所得粗产品放在水与乙醇为体积比1:1的混合溶液中加热回流一个小时后过滤，再加入氯化锂充分搅拌；最后蒸发溶液中的乙醇，剩下的水溶液冷却后再继续放在冰浴中冷却；静置24个小时后，溶液中析出黑色晶体；过滤，真空干燥得到化合物3纯品。
9.权利要求I所述的化学结构式I的分子探针的应用，其特征在于将化学结构式为I 的分子探针与单链和/或双链DNA溶解于HCl-Tris缓冲液中配制成水溶液，复合所得到的荧光探针用于单链和/或双链DNA的荧光分析。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的Tris-HCl为弱酸性或弱碱性。
全文摘要
本发明属于材料制备技术领域，涉及一种检测单链和/或双链DNA的分子探针及其应用。本发明通过对现有技术中的合成方法进行了优化，并优化合成了[Ru(bpy)2(dppz)]2+，发现其具有单链和双链两种探针的作用。发明人初步认为是通过合成方法的优化造成了其分子的空间构形发生了改变，即通过本发明所述的合成方法得到的异构体与DNA的键合方式都存在差异，使得本发明的分子探针具有单链探针的作用，发明人将对该作用机理进行进一步的探索研究。
文档编号G01N33/542GK102590494SQ201210006970
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者刘会祥, 唐雪梅, 宋荣斌, 梅亚军, 田丹碧, 马玉洁 申请人:南京工业大学