专利名称：抗iv型胶原酶单链抗体与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白scFv-LDP的构建产生，它是一种新型兼具细胞毒和抑制侵袭转移的双功能小型化单抗导向药物。
本发明的目的主要是从小型化、高效化以及选用新型靶点着手研制新型单抗导向药物。本发明目前未见类似报道。
酵母属于单细胞低等真核生物，一方面具有原核生物易于培养、生长繁殖快、便于基因工程操作等特性，另一方面又具有真核生物的蛋白翻译后加工能力。因此，用酵母表达体系高效表达真核外源蛋白目前受到广泛研究和应用。本发明是在甲醇营养型酵母Pichia pastoris中生产重组融合蛋白。
本项发明的内容和要点包括以下步骤1.抗IV型胶原酶单抗片段scFv基因的克隆构建本部分使用Pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统试剂盒产生scFv片段。以抗IV型胶原酶杂交瘤细胞3D6mRNA为模板，分别扩增出抗体轻、重链可变区基因。然后用一段编码(GGGGS)3的linker序列，经重组PCR将抗体轻、重链可变区基因连接构建成scFv片段(
图1)。将此基因片段克隆进质粒pCANTAB5E(Pharmacia公司)构建重组噬菌体抗体库。用IV型胶原酶对文库进行两轮免疫淘选后得到一株对抗原有最高亲和力的重组噬菌体抗体43#。ScFv-43基因片段由上海生工生物工程公司进行序列测定，全长744bp，编码248个氨基酸。该基因序列与专利99121668.7中的scFv基因序列92.2％同源(图2)。两个scFv片段都是抗IV型胶原酶，但本发明所涉及的scFv片段的起源杂交瘤细胞3D6比专利99121668.7中的scFv片段的起源杂交瘤细胞C2H5对抗原具有更强的亲和力，因此具备更高的肿瘤靶向性。
2.ScFv-LDP融合基因的构建重组质粒pCANscFv、pC由本实验室构建，分别含有scFv和LDP基因片段。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。PH1(scFv 5’端引物)5’ATCTCGAGAAAAGAGAGGCCCAGGTGAAGCTG 3’XhoIPL2(scFv 3’端引物)5’CGCCATGGTGAACCGCCTCCACCACGTTTGATTTC3’Nco I spacerPLD1(LDP 5’端引物)5’CATGCCATGGGCGCCCGCCTTCTCCGTCAGTC 3’Nco IPLD2(LDP 3’端引物)5’GTGAATTCTCAGCCGAAGGTCAGAGCCAC 3’EcoR I以质粒pCANscFv为模板，PH1、PL2为引物进行PCR扩增，获得长约800bp的scFv基因片段(图3)，分离纯化后用Xho I和Nco I双酶切。同时以质粒pC为模板，PLD1和PLD2为引物PCR扩增LDP基因，获得约340bp的扩增片段(图3)，分离纯化后用Nco I和EcoR I双酶切。将上述两个片段与经Xho I和EcoRI酶切的质粒pPIC9(Invitrogen公司)进行连接，获得重组质粒pPIC9-Fv1027。由上海生工生物工程公司进行序列测定，融合基因读码框插入正确，整个基因全长1095bp，编码365个氨基酸。通过分析计算机同源模建的scFv三维结构以及LDP的X-衍射三维结构，在scFv的C-端和LDP的N-端附加一段小肽spacer，以使两部分的空间构象不至于相互影响。为了以后克隆替换的方便，在两个基因之间还引入Nco I酶切位点(图9)。
3.融合蛋白在酵母中的产生本发明所使用的表达体系是甲醇营养型毕赤酵母Pichia pastoris GS115/pPIC9K(Invitrogen公司)。构建的融合基因两端分别是Xho I、EcoR I酶切位点，但质粒pPIC9K有两个Xho I酶切位点。因此首先是将融合基因经Xho I、EcoR I位点亚克隆至质粒pPIC9构建重组质粒pPIC9-Fv1027，然后选定Sph I、EcoR I酶切将含融合基因片段亚克隆至表达载体pPIC9K构建重组表达质粒pKFv1027(图4)。重组质粒pKFv1027经酶切分析鉴定插入正确(图5)。重组质粒pKFv1027经Bgl II酶切线性化并纯化后，电转化PichiapastorisGS115，用MD培养基(含YNB1.34％，生物素4×10-5％，葡萄糖1％)及含不同浓度G418的YPD培养基(含酵母浸出物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％)平板筛选阳性多拷贝重组转化子。挑取转化子G34，提取基因组DNA，以5’AOX1引物(5’GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3’)和3’AOX1引物(5’GCAAATGGCATTCTGACATCC 3’)进行PCR鉴定(图6)，表明外源融合基因通过5’AOX1序列和3’AOX1序列双交换同源重组整合进酵母基因组中，其表型为His+Muts。将G34接种至50ml BMGY培养基(Invitrogen公司)，30℃振荡培养至OD600约3。离心收集菌体，用5ml BMMY培养基(Invitrogen公司)重悬，30℃振荡培养进行诱导表达。每隔24小时补加甲醇至终浓度1％，4天后离心收集上清。用抗LDM单抗F9(本实验室构建)做为一抗进行Western blot分析，G34成功地表达了可溶性重组融合蛋白(图7)。
4.融合蛋白scFv-LDP的免疫反应性将IV型胶原酶按1μg/100μl/孔包被96孔酶标板，以100μl 10％脱脂奶粉进行封闭。加入酵母表达上清，孵育后洗去。加入抗LDM单抗F9再次孵育，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，以邻苯二氨为底物进行显色，酶标仪测定490nm处吸光值。结果表明，融合蛋白仍保留了单抗对抗原IV型胶原酶的免疫反应性(图8)。
5.融合蛋白scFv-LDP抑制血管生成将表达上清用截留分子量为10kDa的超滤浓缩膜浓缩20倍后，用鸡胚尿囊膜法检测对血管生成抑制作用。结果表明，在酵母中产生的融合蛋白scFv-LDP能抑制血管生成(表1)。
本发明的优点与积极效果是运用基因工程手段获得小型化的单抗片段，在此基础上构建产生融合蛋白scFv-LDP，这为加入LDC生成组装型单抗导向药物scFv-LDM奠定了基础。该策略可以最大限度地确保维持LDM的活性。运用酵母表达体系可以经济、方便、大量地生产融合蛋白，因而为研制兼具强烈杀伤肿瘤细胞活性和抑制侵袭转移活性的双功能小型化单抗导向药物打下了基础。
序列表<110>中国医学科学院医药生物技术研究所<120>抗IV型胶原酶单链抗体与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白<160>1<170><210>1<212>DNA<213>毕赤酵母(Pichia pastoris)<220><221>misc_feature<222><223><400>1atggcccagg tgaagctgca gcagtctgga actgaagtgg taaagcctgg ggcttcagtg 60aagttgtcct gcaaggcttc tggctacatc ttcacaagtt atgatataaa ctgggtgagg 120cagacgcctg aacagggact tgagtggatt ggatggattt ttcctggaga ggggagtact 180gaatacaatg agaagttcaa gggcagggcc acactgagtg tagacaagtc ctccagcaca 240gcctatatgg agctcactag gctgacatct gaggactctg ctgtctattt ctgtgctaga 300ggggactact ataggcgcta ctttgacttg tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgga catcgagctc 420actcagtctc cagcttcttt ggctgtgtct ctagggcaga gggccaccat atcctgcaga 480gccagtgaaa gtgttgatac ttatggcgat acttttatgt actggtacca gcagaaacca 540ggacagccac ccaaactcct catctatctt gcaaccaacc taggatctgg ggtccctgcc 600aggttcagtg gcagtgggtc taggacaaac ttcaccctca ccattgatcc tgtggaggct 660gatgatgctg caacctatta ctgtcagcaa aataatgagg atccgtacac gttcggaggg 720ggcaccaagc tggaaatcaa acgt74权利要求
1.抗IV型胶原酶单链抗体(scFv)与力达霉素辅基蛋白(LDP)的融合蛋白(scFv-LDP)，其特征是所说方案的实施包括以下步骤A.抗IV型胶原酶scFv基因的克隆构建；B.ScFv-LDP融合基因的构建；C.融合蛋白酵母表达质粒的构建；D.融合蛋白在酵母中的可溶性表达；E.融合蛋白的生物学活性测定。
2.按照权利要求1所述的融合蛋白，其特征是从抗IV型胶原酶杂交瘤细胞3D6中反转录PCR扩增抗体轻、重链可变区基因，然后用一段连接序列连接构建scFv基因。
3.按照权利要求1所述的融合蛋白，其特征是运用基因工程技术，用编码一段柔性小肽的DNA序列将scFv基因与LDP基因连接成scFv-spacer-LDP形式的融合基因，同时，在spacer区引入相应酶切位点。
4.按照权利要求1所述的融合蛋白，其特征是融合基因克隆至酵母表达质粒，如pPIC9K等构建重组表达质粒pKFv1027。
5.按照权利要求1所述的融合蛋白，其特征是Bgl II线性化pKFv1027经电击转化酵母表达宿主系统如Pichia pastoris获得阳性克隆转化子，经诱导后表达可溶性融合蛋白。
6.按照权利要求1所述的融合蛋白，其特征是ELISA检测产生的融合蛋白对抗原IV型胶原酶的结合能力，用鸡胚尿囊膜法检测融合蛋白抑制血管生成能力。
全文摘要
本发明涉及一种小型化融合蛋白scFv－LDP的构建产生，其实施方案是运用DNA分子重组技术、基因工程技术，构建了抗IV型胶原酶单链抗体(Single－chain Fv fragment，scFv)基因和力达霉素辅基蛋白(LDP)基因的融合基因，在甲醇营养型酵母Pichia pastoris中实现了分泌表达，表达的融合蛋白保留了对抗原IV型胶原酶的结合能力，同时对鸡胚尿囊膜血管生成有抑制作用，该融合蛋白有望成为兼具强烈杀伤肿瘤细胞活性和抑制侵袭转移活性的双功能小型化单抗导向药物。
文档编号C07K14/36GK1403577SQ01131299
公开日2003年3月19日 申请日期2001年9月6日 优先权日2001年9月6日
发明者甄永苏, 唐勇 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所