细胞穿透肽(Arg)₉与力达霉素融合蛋白(Arg)₉-LDP的制作方法

专利名称：细胞穿透肽(Arg)₉与力达霉素融合蛋白(Arg)₉-LDP的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白(Arg)9_LDP，具体来讲，所说融合蛋白含有细胞穿透肽 (Arg)9和力达霉素辅基蛋白LDP的氨基酸序列；本发明还涉及一种可以经过分子强化制备的含有烯二炔类发色团(AE)的强化融 合蛋白(Arg)9-LDP-AE ；本发明还涉及所说融合蛋白及其强化融合蛋白在肿瘤治疗中的应用。
背景技术：
力达霉素(lidamycin，LDM，又称C-1027)，是从我国湖北省潜江县土壤中分离得 到的一株球孢链霉菌Str印tiomyces globisporus C-1027 (2007年4月3日保藏于CGMCC， 菌种保藏号为CGMCC No. 0704)产生的烯二炔类抗生素，由烯二炔发色团(AE)和110个氨 基酸残基组成的辅基蛋白(LDP)两部分构成，两者通过发色团核心和辅基蛋白疏水氨基酸 残基的疏水作用结合。发色团有强烈活性，但不稳定，辅基蛋白折叠成一个疏水口袋保护发 色团的稳定性，辅基蛋白和发色团可拆分和重建，重建后的分子与天然分子活性相当，这种 独特的可拆分的分子结构特点，便于DNA重组以及分子强化。力达霉素对体外培养的肿瘤细胞有强烈的杀伤作用，按IC5(I进行比较，比阿霉素 和丝裂霉素强1000倍以上，动物体内实验表明力达霉素对移植性小鼠结肠癌26以及移植 于裸鼠的人肝癌Bel-7402和盲肠癌Hee_8693等有显著疗效。分子药理学研究表明，其主 要作用机制是引起DNA断裂，从而诱导细胞凋亡。由于细胞膜的选择通透性和血脑屏障的 存在，力达霉素对脑组织肿瘤的杀伤作用迄今为止尚未见有国内外的相关报道。细胞穿透肽(cell penetrating p印tides，CPPs)是一类以非受体依赖方式、非经 典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽，它们的长度一般不超过30个氨基酸且富含 碱性氨基酸，能引导各类生物活性物质迅速地穿过细胞膜和(或)核膜。目前已经发现及 合成的CPPs有数十种，根据其来源大致可分为三类，(一)来源于同源结构域的穿透肽，如 Penetratin ； (二)来源于病毒或微生物的天然存在蛋白，如TAT、Antp、VP22和PreS2等； (三)人工合成的各种短肽如多聚精氨酸、MAP、Transportan和各种基于信号序列合成的 肽段，如MTS等。迄今的研究提示，CPPs能在体外或体内介导一系列生物活性分子如蛋白 质、肽类、寡聚核苷酸、DNAs、质粒及脂质体等进入各种不同组织和细胞，这些重要发现将为 亲水性蛋白、寡肽及寡核苷酸应用于药学、基因治疗、细胞生物学等研究领域提供新的研究 方向。对细胞穿透肽的氨基酸序列分析发现，细胞穿透肽都是富含精氨酸的，因此，精氨 酸可能在细胞穿透肽穿透细胞膜或是核膜过程中起着重要作用，多聚精氨酸(Arg)9就是以 此为依据人工合成的细胞穿透肽，能够携带多种物质进入细胞，具有很好的穿膜活性。以往 的研究中都是通过化学方法把多聚精氨酸(Arg)9与蛋白偶联，通过基因工程的方法将多聚 精氨酸仏『力9与蛋白形成融合蛋白，目前尚未见有相关报道。本发明采用基因工程的方法表达细胞穿透肽(Arg)9与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白(Arg)9-LDP，与化学合成方法相比，基因工程方法生产蛋白的成本更低，产量更高，易 于纯化和浓缩，无中间副产物的影响。本发明的目的之一是，构建细胞穿透肽(Arg)9与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白 (Arg)9-LDP ；本发明的目的之二是，进一步用具有高活性的活化型烯二炔(AE)进行分子强化， 构建强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE ；

发明内容
本发明所提供的融合蛋白(Arg)9-LDP是由细胞穿透肽(Arg)9和力达霉素辅基蛋 白LDP构成的，基因全长387bp，编码129个氨基酸；其强化融合蛋白(Arg)9_LDP_AE是由融 合蛋白以及活化型烯二炔发色团AE组装而成，其制备方法为
DNA重组技术分子强化技术 本发明利用基因工程的方法表达细胞穿透肽(Arg)9与力达霉素辅基蛋白的融合 蛋白及其强化融合蛋白，用于神经胶质瘤的药物治疗。本发明所提供的融合蛋白(Arg)9-LDP及其强化融合蛋白(Arg)9_LDP_AE，其制备 方法包括以下步骤融合蛋白(Arg) 9-LDP重组表达质粒的构建；融合蛋白(Arg)9-LDP在大肠埃希氏菌BL21 (DE3) star 中的诱导表达；融合蛋白(Arg)9_LDP的亲和层析纯化及复性；强化融合蛋白(Arg) 9-LDP-AE的制备分离。本发明还提供了融合蛋白(Arg)9-LDP及其强化融合蛋白(Arg)9_LDP_AE的生物学 活性实验研究，包括融合蛋白(Arg)9_LDP的穿膜能力测定；MTT法检测强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE对U87细胞、Bel-7402细胞、MCF-7细胞 和A549细胞的细胞毒作用；强化融合蛋白(Arg) 9-LDP-AE对人神经胶质瘤U87细胞周期的影响；强化融合蛋白(Arg) 9-LDP-AE对U87的凋亡诱导作用；融合蛋白(Arg) 9-LDP及其强化融合蛋白(Arg) 9_LDP_AE对小鼠肝癌H22的生长抑 制作用；融合蛋白(Arg)9-LDP及其强化融合蛋白(Arg) 9_LDP_AE对人神经胶质瘤裸鼠移植 瘤的生长抑制作用。发明效果本发明的优点与积极效果在于，应用基因工程技术和分子强化技术路线制备获得 的融合蛋白(Arg)9-LDP及其强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE，是具有穿透细胞膜活性的融合 蛋白药物，能引导力达霉素穿透细胞膜，促进肿瘤细胞凋亡，在体内抑制肿瘤生长，具有良 好的临床应用前景。


图1 :pET30_ (arg) 9ldp重组表达载体构建过程图2 :PCR扩增(arg) 9ldp基因片段其中1-DNA分子量标准 DL2000 (bp)；3_(arg)9ldp 基因；图3 :pET30- (arg) 9ldp重组表达载体的内切酶分析其中1-DNA分子量标准 DL2000 (bp)；2-重组质粒 pET30- (arg) 9ldp ；3-重组质粒 pET30_ (arg) 9ldp+Nde I ；4-重组质粒 pET30_ (arg) 9ldp+Xho I ；5-重组质粒 pET30_(arg)9lap+Nde I/Xho I ；6-DNA 分子量标准 DL15000(bp)；图4 融合蛋白(Arg) 9_LDP表达产物的SDS-PAGE分析其中1、10_IPTG诱导后重组菌全细胞蛋白；2、9_IPTG诱导后重组菌包涵体蛋白；3-IPTG诱导后重组菌胞内可溶性蛋白；4-IPTG诱导后重组菌周质腔蛋白；5-IPTG诱导后重组菌培养液上清蛋白；6-蛋白分子量标准(kDa)；7-IPTG诱导前重组菌包涵体蛋白；8-IPTG诱导前重组菌全细胞蛋白；图5 融合蛋白(Arg)9_LDP表达产物的免疫印迹分析其中1-IPTG诱导后重组菌菌液全细胞蛋白；2-IPTG诱导后重组菌包涵体蛋白；3-IPTG诱导后重组菌胞内可溶性蛋白；4-IPTG诱导后重组菌周质腔蛋白；5-IPTG诱导后重组菌培养液上清蛋白；图6 融合蛋白(Arg) 9_LDP纯化产物的SDS-PAGE分析其中1_蛋白分子量标准(kDa)；2-IPTG诱导后重组菌全细胞蛋白；3-经尿素溶解的重组菌包涵体；4 7-纯化的融合蛋白(Arg) 9_LDp ；图7 荧光检测(Arg)9_LDP融合蛋白穿透细胞膜能力其中l-Bel-7402细胞；2-A549 细胞；3-H460 细胞；4-0VCAR3 细胞；5-U87 细胞。
图8 荧光检测(Arg)9_LDP融合蛋白在肿瘤细胞中的定位其中1_A549细胞；2-H460 细胞；3-0VCAR3 细胞。图9 荧光检测不同时间(Arg)9_LDP融合蛋白穿透肿瘤细胞能力其中:A1 A5 为 U87 细胞与 BSA-FITC 孵育 2h、3h、4h、5h 和 6h ；B1 B5 为 U87 细胞与 rLDP-FITC 孵育 2h、3h、4h、5h 和 6h ；C1 A5 为 U87 细胞与(Arg) 9_LDP_FITC 孵育 2h、3h、4h、5h 和 6h。图10 流式细胞仪检测(Arg)9_LDP融合蛋白穿透肿瘤细胞能力其中 -(Arg)9-LDP-FITC ；■ -rLDP-FITC ；▲ -BSA-FITC。图11 流式细胞仪检测温度对(Arg)9_LDP融合蛋白穿透U87细胞能力的影响其中 -(Arg)9-LDP-FITC 37°C ；■ - (Arg) 9-LDP-FITC 4°C ；▲ -rLDP-FITC 37°C ； -rLDP-FITC 4°C。图12 流式细胞仪检测温度对(Arg)9_LDP融合蛋白穿透A549细胞能力的影响其中 - (Arg)9-LDP-FITC 37°C ；■ - (Arg) 9-LDP-FITC 4°C ；▲ -rLDP-FITC 37°C ； -rLDP-FITC 4°C。图13 强化融合蛋白(Arg)9-LDP_AE对Bel_7402细胞的细胞毒作用其中_-LDM;▲ - (Arg) g-LDP-AE。图14 强化融合蛋白(Arg) 9_LDP_AE对MCF-7细胞的细胞毒作用其中_-LDM;▲ - (Arg) g-LDP-AE。图15 强化融合蛋白(Arg) 9_LDP_AE对0VCAR3细胞的细胞毒作用其中_-LDM;▲ - (Arg) g-LDP-AE。图16 强化融合蛋白(Arg)9-LDP_AE对U87细胞的细胞毒作用其中_-LDM;▲ - (Arg) g-LDP-AE。图17 强化融合蛋白(Arg)9-LDP_AE对U87细胞周期的影响其中 “-Control ；2- (Arg) g-LDP-AE 0. lpM ；3- (Arg) g-LDP-AE lpM ；4-(Arg)g-LDP-AE 0. OlnM ；
5-(Arg) 9-LDP-AE 0. InM ；6-(Arg) 9-LDP-AE InM。图18 强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE对U87细胞的凋亡诱导作用
其中:l-Control ；2-(Arg)9-LDP-AE0. OlnM ；3-(Arg) 9-LDP-AE 0. 05nM ；4-(Arg) 9-LDP-AE 0. InM ；5-(Arg) 9-LDP-AE 0. 5nM ；6-(Arg) 9-LDP-AE InM。图19 强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE对U87细胞的凋亡诱导作用
其中國-细胞凋亡率；
_-细胞死亡率；1-Control；2-(Arg)9-LDP-AE0. OlnM ；3-(Arg) 9-LDP-AE 0. 05nM ；4-(Arg) 9-LDP-AE 0. InM ；5-(Arg) 9-LDP-AE 0. 5nM ；6-(Arg) 9-LDP-AE InM。图20 强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE对肝癌H22移植瘤小鼠瘤重的影响
其中:l-Control ；2-(Arg)9-LDP10mg/kg ；3-LDM0. 05mg/kg ；4-(Arg) 9-LDP-AE 0. 3mg/kg ；5-(Arg) 9-LDP-AE 0. 2mg/kg ；6-(Arg) 9-LDP-AE 0. lmg/kg。图21 强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE对肝癌H22移植瘤小鼠体重的影响
其中 -Control ；
_-(Arg)9-LDP 10mg/kg ；▲-LDM 0. 05mg/kg ； -(Arg)9-LDP-AE 0. 3mg/kg ；
〇-(Arg) 9-LDP-AE 0. 2mg/kg ；
△ - (Arg) 9-LDP-AE 0. lmg/kg。图22 强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE处理的人神经胶质瘤U87裸鼠移植瘤的生长曲线其中 -Control ；
_-(Arg)9-LDP 10mg/kg ；▲-LDM 0. 05mg/kg ；□ -(Arg) 9一LDP 10mg/kg+LDM 0. 05mg/kg ； -(Arg)9-LDP-AE 0. 3mg/kg ；
〇-(Arg) g-LDP-AE 0. 2mg/kg ；A _(Arg)9-LDP-AE 0. lmg/kg0实施方案以下实施例，可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制 本发明。<实施例1>.融合蛋白(Arg)9_LDP重组表达质粒pET30_ (arg) 9ldp的构建重组质粒pET30-vhldp (专利CN200410034052. 7)中带有 LDP 基因，。通过 PCR 引 入NdeI、XhoI两个酶切位点，(引物由Invitrogen公司合成)。上游弓I物5 ‘ GAATTCCATATG CGTCGTCGCCGCCGTCGTCGCCGCCGT
GGCGCGCCCGCCTTCTCCGT 3 ‘(下划线部分为Nde I酶切位点，斜体部分为(arg) 9基因)下游引物5'GTTACTCGAG GCCGAAGGTCAGAGCCACGTG3‘(下划线部分为 Xho I 酶 切位点)重组表达质粒pET30-(arg)9ldp的构建过程如图1所示。以重组质粒pET30_Vhldp 为模板进行PCR扩增，获得(arg)9ldp基因片段(图2)。PCR反应体系为94°C变性5min后 进行30个循环的扩增反应94°C变性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸lmin，最后一个循环 结束后在72°C保温lOmin。PCR产物利用玻璃奶回收试剂盒(BioDev公司产品)纯化回收 后，用NdeI、Xho I进行双酶切。回收酶切片段，克隆至经同样双酶切的pET_30a(+)(购自 Invitrogen公司产品)中，得到重组质粒pET30_ (arg) 9ldp。用Ndel和Xhol酶进行双酶切 鉴定(图3)。测序结果显示融合蛋白(Arg)9-LDP基因全长387bp，编码129个氨基酸，其 中细胞穿透肽基因全长30bp，编码10个氨基酸，LDP基因全长330bp，编码110个氨基酸， 二者之间的柔性肽基因长3bp，编码1个氨基酸，羧基端的组氨酸六聚体尾基因长18bp，编 码6个氨基酸，引入酶切位点6bp。<实施例2>.融合蛋白(Arg)9-LDP在大肠埃希氏菌BL21 (DE3) star 中诱导表达鉴定后的pET30-(arg)9ldp重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21 (DE3) star (Invitrogen公司产品)，随机挑取重组转化子接种到3ml含有50 u g/ml卡那霉素 的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜。次日按照5%的比例接种，37°C震荡培养至0D600 为0. 8，加入IPTG至终浓度为0. 2mM，诱导培养8h。取适量菌液，对全菌、培养基上清、细胞 周质腔组分、可溶性胞质组分及包涵体组分进行表达产物定位分析。15% SDS-PAGE电泳和 免疫印迹结果显示，融合蛋白分子量约为14. 5kDa以不可溶形式表达于包涵体中(图4、图 5)。凝胶成像系统定量分析显示，以最佳条件诱导表达所得的融合蛋白表达量占菌体总蛋 白8%左右。含有重组质粒pET30a-arg91dp，能够表达融合蛋白(Arg)9_LDP的转化菌株命 名为CAMS/(Arg)9-LDP，于2010年5月送交位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心保藏，分类大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号(CGMCC N0. 3815)。<实施例3>.融合蛋白(Arg) 9_LDP亲和层析纯化及分离制备3.1包涵体蛋白的提取取经IPTG诱导的重组菌培养物10000g离心lOmin，尽量去除上清，收集菌体。每 1L培养体积的菌体用100ml的20mM Tris-HCl进行重悬。超声波处理破碎细胞。4°C 10000g 离心15min，收集包涵体和细胞碎片蛋白，弃去上清。用100ml的不含尿素的lXBinding Buffer (20mM Tris-HCl,0. 5M NaCl，5mM 咪唑，pH8. 0)重悬沉淀。4°C lOOOOg 离心 15min，弃去上清，收集沉淀。重复上述操作步骤，用50ml lXBinding Buffer(20mM Tris-HCl, 0. 5丽aCl，5mM咪唑，8M尿素，pH8. 0)重悬沉淀，冰浴lh完全溶解包涵体蛋白。4°C 15000g 离心30min，去除不可溶物质。收集上清，用0. 45 y m膜过滤后，储存于4°C以待亲和层析纯 化。3. 2融合蛋白(Arg) 9_LDP亲和层析纯化采用His-Trap HP纯化柱(Amersham公司产品)纯化蛋白样品。经预处理亲和柱 后，以6倍柱体积含1 XBinding Buffer平衡层析柱，可溶蛋白样品上柱后，分别以10倍体 积 lXBinding Buffer 和 6 倍体积 1 XWashing Buffer (20mM Tris-HCl,0. 5M NaCl,20mM 咪唑，8M尿素，pH8. 0)洗涤层析柱，最后以6倍体积IXElute Buffer (20mM Tris-HCl, 0. 5M NaCl，500mM咪唑，8M尿素，pH8. 0)洗脱结合蛋白，收集洗脱组份，获得纯化后的融合蛋白 (Arg)9-LDP (图 6)。3. 3融合蛋白(Arg) 9_LDP的透析复性将浸在EDTA(乙二胺四乙酸二钠)中的透析袋用蒸馏水清洗干净，装满水然后 排出。将洗脱的蛋白用lXBinding Buffer稀释至15 iiM，加入2-巯基乙醇至终浓度为 10mM，室温放置30min。将还原的蛋白用至少50倍样品体积的复性液(50mM Tris-HCl, ImM EDTA, 200mM NaCl，6M尿素，pH8. 0)4°C透析过夜，以除去还原剂。用尿素浓度依次递减 的复性液(3M，2M，1M，0.5M，0M尿素)将样品进行分步透析。在尿素浓度为1M阶段，加入 750 u M的氧化型谷胱甘肽和400mM的L-精氨酸。将最后一步透析所得样品再用50倍体 积的PBS(pH7.4)进行透析。每12h更换一次透析液，共2次。将透析后的样品4°C lOOOOg 离心30min，收集上清，即得到复性融合蛋白(Arg)9-LDP。〈实施例4>.强化融合蛋白(Arg)9-LDP_AE的制备4.1活性发色团(AE)的制备取高活性的LDM冻干品(专利申请号:001215272，公开号1284566) 10mg，加5ml 冷甲醇振摇5min，-2(TC放置lh，中间振摇1次；0°C，12000rpm离心20min，上清中富含发色 团AE，沉淀为肽链，重复提取2次。4°C，避光蒸发浓缩发色团，-70°C保存。4. 2强化融合蛋白(Arg) 9_LDP_AE的制备分离取一定体积和浓度的融合蛋白(Arg)9_LDP溶于PBS(pH7. 4)中，加入3倍摩尔数 的AE甲醇溶液，混合振摇，室温反应12h。将混合液用PD-10柱(商业化的S印hadex G_25 柱，Pharmacia产品)层析分离，经280nm、343nm紫外监测后，弃去过量未反应的AE，收集强 化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE。<实施例5>.荧光检测融合蛋白(Arg)9_LDP的穿透细胞膜能力5.1 FITC标记融合蛋白(Arg)9-LDP、力达霉素重组辅基蛋白rLDP和牛血清白蛋 白BSA将融合蛋白(Arg) 9-LDP，、力达霉素重组辅基蛋白rLDP和牛血清白蛋白BSA用 碳酸盐缓冲液(Na2C03 0. 16mol/L, NaHC03 0. 33mol/L, pH 9.5)透析过夜。称取 FITC(异 硫氰酸盐)，溶于DMS0 (二甲基亚砜)中，终浓度为lmg/ml。将透析过的蛋白溶液置于小 瓶中，按150iigFITC/mg蛋白的比例，边滴加边混勻FITC溶液。于4°C避光混勻12_18h。 用PBS透析去除未结合的FITC。计算荧光素与蛋白的结合比率F/P :F/P = 3. 1XA495/ (A280-0. 31XA495)，该值应介于 2. 5-6. 5 之间。
5. 2荧光检测融合蛋白(Arg)9_LDP穿透肿瘤细胞膜能力收集对数生长期的Bel-7402细胞、A549细胞、H460细胞、0VCAR3细胞和U87细 胞并计数，用培养基重悬细胞，以每孔5X105细胞的量加入到6孔培养板中，37°C培养 过夜。弃去原培养液，加入新的培养基，并加入终浓度为20 y M的FITC标记的融合蛋白 (Arg)9-LDP-FITC，37°C作用2h。弃去上清，用PBS洗3次，加入甲醇，置于摇床摇lOmin，吸 弃甲醇。再次加入甲醇，置于-20°C固定lOmin，用PBS洗3次，加入400 yl含有50%甘油 的PBS封片，倒置荧光显微镜下观察、照相。结果(图7)显示，与融合蛋白(Arg)9-LDP-FITC 孵育后，五种肿瘤细胞的内部均有较强的绿色荧光反应，说明带有穿透肽的融合蛋白可以 穿透细胞膜进入细胞内部。5. 3荧光检测融合蛋白(Arg)9_LDP在肿瘤细胞中的定位收集对数生长期的A549细胞、H460细胞和0VCAR3细胞并计数，用培养基重悬细 胞，以每孔5X 105细胞的量加入到6孔培养板中，37°C培养过夜。弃去原培养液，加入新的 培养基，并加入终浓度为20iiM的FITC标记的融合蛋白(Arg)9-LDP-FITC，37°C作用2h。弃 去上清，用PBS洗3次，加入甲醇，置于摇床摇lOmin，吸弃甲醇。再次加入甲醇，置于_20°C 固定lOmin，吸弃甲醇，用PBS洗3次，加入终浓度为终浓度为lii g/ml的DAPI，室温避光反 应30min。用PBS洗3次，加入400 u 1含有50%甘油的PBS封片，倒置荧光显微镜下观察、 照相。结果(图8)显示，与融合蛋白(Arg)9-LDP-FITC孵育后，三种肿瘤细胞内部均有较 强的绿色荧光反应，用DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)对细胞核进行复染，发现绿色荧 光反应主要存在于细胞质中，同时细胞核中也有较弱的绿色荧光反应，说明带有穿透肽的 融合蛋白可以穿透细胞膜进入细胞内部。5. 4荧光检测不同时间融合蛋白(Arg)9_LDP穿透肿瘤细胞能力收集对数生长期的U87细胞并计数，用培养基重悬细胞，以每孔5X105细胞的 量加入到6孔培养板中，37°C培养过夜。弃去原培养液，加入新的培养基，于不同时间加 入终浓度为20iiM的FITC标记的融合蛋白(Arg)9-LDP-FITC、FITC标记的重组辅基蛋白 rLDP-FITC和FITC标记的牛血清白蛋白BSA-FITC，37°C孵育。弃去上清，用PBS洗3次， 加入甲醇，置于摇床摇lOmin，吸弃甲醇。再次加入甲醇，置于_20°C固定lOmin，吸弃甲醇， 用PBS洗3次。加入终浓度为1 P g/ml的DAPI，室温避光反应30min。用PBS洗3次，加 入400 yl含有50%甘油的PBS封片，倒置荧光显微镜下观察、照相。结果(图9)显示， (Arg)9-LDP-FITC孵育2小时，细胞内可以看到明显的绿色荧光，随着时间的延长，细胞内 的绿色荧光强度逐渐增强，rLDP-FITC组和BSA-FITC组细胞内也有少量绿色荧光，但是随 着时间的延长，胞内绿色荧光强度无明显变化，与(Arg)9-LDP-FITC组相比有明显差异。<实施例6〉.流式细胞仪检测融合蛋白(Arg) 9_LDP穿透细胞膜能力6. 1流式细胞仪检测融合蛋白(Arg)9_LDP穿透细胞能力取对数生长期的U87细胞，用胰酶消化后计数，调整细胞5X105个/ml，以每管 lml分装至19个离心管中。lOOOrpm离心5分钟，收集细胞，用PBS洗涤细胞3次。分别 加入终浓度为20 ii M的FITC标记的融合蛋白(Arg)9-LDP-FITC、FITC标记的重组辅基蛋白 rLDP-FITC和FITC标记的牛血清白蛋白BSA-FITC，用反应缓冲液(PBS+2% FBS)补足体积 至100 ill，37 °C孵育，分别于0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3h取样，同时设置不加蛋白的阴性对照管。 4°C离心后，用4%台盼蓝溶液重悬细胞团，室温lOmin。用反应缓冲液(PBS+2% FBS)洗细
10胞3次；用FACS机器检测荧光强度。以荧光强度为纵坐标，以取样时间为横坐标作时间反 应曲线。如图10所示，在0.5-3h中，进入细胞的融合蛋白(Arg)9-LDP-FITC随着用时间的 延长而明显增加，rLDP-FITC组和BSA-FITC组的胞内荧光强度随时间的延长无明显增加， 与(Arg)9-LDP-FITC组相比有明显差异。6. 2流式细胞仪检测温度对融合蛋白(Arg)9_LDP穿透细胞能力的影响取对数生长期的U87细胞和A549细胞，用胰酶消化后计数，调整细胞5 X 105个/ ml，以每管1ml分装至13个离心管中。lOOOrpm离心5分钟，收集细胞，用PBS洗涤细胞3 次。分别加入终浓度为20 ii M的FITC标记的融合蛋白(Arg)9-LDP-FITC和FITC标记的重组 辅基蛋白rLDP-FITC，用反应缓冲液(PBS+2% FBS)补足体积至100 yl，分别于4°C和37°C 孵育，于0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3h取样，同时设置不加蛋白的阴性对照管。4°C离心后，用4%台 盼蓝溶液重悬细胞团，室温lOmin。用反应缓冲液(PBS+2% FBS)洗细胞3次；用FACS机器 检测荧光强度。以荧光强度为纵坐标，以取样时间为横坐标作时间反应曲线。结果如图11 所示，(Arg)9-LDP-FITC组37°C条件下U87细胞内荧光强度随时间延长明显增加，4°C条件 下，U87细胞内荧光强度随时间延长无明显变化，rLDP-FITC组4°C和37°C条件下U87细胞 内荧光强度随时间延长均无无明显增加，说明(Arg)9-LDP-FITC可以穿透细胞膜进入细胞 内部，其穿透过程与温度有关，是一个能量消耗过程。A549细胞中也得到同样的实验结果， 如图12所示。<实施例7>. MTT法检测强化融合蛋白(Arg) 9_LDP_AE对肿瘤细胞的细胞毒作用取对数生长期的MCF-7细胞、Bel-7402细胞、U87细胞和0VCAR3细胞消化、计数， 4000个/孔铺于96孔板。37°C 5% C02培养24h后，加入不同浓度的强化融合蛋白/力达 霉素，每个药物浓度设6个平行孔。培养48h后，每孔加入20 u 1 MTT (5mg/ml)，37°C继续培 养4h。吸弃培养基，加入150 ill DMS0，摇床振荡lOmin，酶标仪测定A570值。计算细胞存 活率及IC5(1值。细胞存活率T/C(%)=(加药组A570值-无细胞对照组A570值)/(无 药对照组A570值-无细胞对照组A570值)X 100%。然后以细胞存活率为纵坐标，药物浓 度为横坐标作浓度反应曲线(图13、图14、图15、图16)。结果显示(表1)，强化融合蛋白与LDM对四种细胞都有强烈的细胞毒作用，强化融 合蛋白和力达霉素对U87细胞和MCF-7细胞的IC50值相近，强化融合蛋白对0VCAR3细胞 和Bel-7402细胞的IC50值分别是力达霉素的1/20和1/10。表1强化融合蛋白和力达霉素对肿瘤细胞的IC5Q值 <实施例8>.强化融合蛋白(Arg) 9_LDP_AE对肿瘤细胞周期的影响将U87细胞按照1.5X105个/孔的密度接种至6孔培养板中，37°C培养24h。待细 胞长至50%-80%时，更换培养基，同时加入不同浓度的强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE。同 时设立不加药空白对照组。作用48h后，收集细胞，用PBS洗2次，加入70%乙醇4°C固定 过夜，PBS洗2次，加入终浓度为50 u g/ml的PI，进行流式细胞仪测定。结果如图17所示， 将InM至0. lpM连续10倍稀释的不同浓度的强化融合蛋白分别作用于U87细胞48h后，经 PI单染，流式细胞仪检测周期分布变化，结果显示，0. lpM的强化融合蛋白可引起细胞的&/ M期阻滞，阻滞程度随着浓度增加而增加，当浓度增加至0. InM和InM时，阻滞程度有所降 低，lpM的强化融合蛋白可引起细胞的S期阻滞，阻滞程度随着浓度增加而增加，如图16所 示，且随着浓度的增加，凋亡细胞数目逐渐增多。〈实施例9>.Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪检测强化融合蛋白 (Arg)9-LDP-AE对肿瘤细胞的诱导凋亡作用按照1. 5X 105个/孔的密度将U87细胞接种于6孔细胞培养板中，37°C环境5 % C02浓度的培养箱中培养24h。更换培养基，加入不同浓度的强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE， 同时设立不加药空白对照组。作用48h后，收集细胞，PBS洗2-3次，lOOOrpm 4°C离心 lOmin，弃上清，细胞重悬于 150ii 1 Binding Buffer 中，加入 10 ii 1 Annexin V-FITC 轻轻混 勻，避光室温反应15min或4°C反应30min，再加入150iU Binding Buffer和5 yl PI，进 行流式细胞仪测定。结果如图18所示，以不同浓度的强化融合蛋白(Arg)9-LDP_AE(0. OlnM、 0. 05nM、0. lnM、0. 5nM和InM)作用于人神经胶质瘤U87细胞48h后，细胞凋亡比率随浓度增 加而升高。其中，0. 01nM、0. 05nM、0. InM和0. 5nM的强化融合蛋白(Arg) 9_LDP_AE作用于人 神经胶质瘤U87细胞，凋亡率分别为20. 1%,21. 9%,28. 1和44. 9%，凋亡比率随浓度增加 而升高，与对照组2. 相比，均存在明显差异。细胞的死亡率分别为4. 8%、6. 9%,8. 7% 和13. 5%，与对照组0. 9%相比，均存在明显差异。InM的强化融合蛋白(Arg)9_LDP_AE作 用于U87细胞的凋亡率为33. 9%，比0. 5nM的(Arg)9_LDP_AE略有降低，但是细胞的死亡率 增加到36%。流式细胞仪检测结果分析见图19所示。<实施例10〉.强化融合蛋白(Arg) 9-LDP-AE对小鼠移植性肝癌H22的生长抑制作 用领取体重为18g_22g的昆明小鼠，随机分组，每组10只。实验第0天，取小鼠肝癌 H22腹水，以生理盐水稀释成细胞数为7. 5X 105个/ml，按每只小鼠0. 2ml接种于小鼠腋窝
12皮下。接种后1、7天分别给于生理盐水、力达霉素、融合蛋白(Arg)9-LDP以及不同剂量组 的强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE，尾静脉注射，0.2ml/只。实验期间每两天记录动物体重， 第11天处死小鼠，剥取瘤块称瘤重，按照抑瘤率(％ )=(对照组瘤重-给药组瘤重)/对 照组瘤重X 100%计算抑瘤率。结果如图20、图 21 和表 2 所示，(Arg)9-LDP 10mg/kg 组，LDMO. 05mg/kg 组的抑 瘤率分别为58. 4%和74. 6%，(Arg)9-LDP-AE 0. 3mg/kg组和0. 2mg/kg组的抑瘤率分别为 89. 2%m 85. 3%，与 LDMO. 05mg/kg 组相比有明显提高，(Arg)9_LDP_AE 0. lmg/kg 组的抑 瘤率为73. 4%，与LDMO. 05mg/kg组接近。各给药组与对照组相比均具有显著性差异，P值 < 0. 01.表2强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE对小鼠肝癌H22移植瘤的生长抑制作用 **与对照组比，P < 0.01<实施例11>强化.融合蛋白(Arg)9-LDP_AE对人神经胶质瘤U87裸鼠移植瘤的 生长抑制作用取6-8周龄的雌性Balb/c裸鼠，体重18 22g。将U87细胞消化成单细胞悬液 后，用无菌生理盐水洗3次，计数。用生理盐水重悬5X 107细胞/ml，每鼠接种0. 2ml于右 侧腋窝皮下。待瘤块长至足够大小时，将其在无菌生理盐水中剪成2X2X2mm3的小块，用 套管针将肿瘤移植到裸鼠右腋窝皮下，用火胶棉将切口粘住。在接种瘤块后第7天，将裸 鼠分组，每组6只裸鼠，各组体重及瘤块大小均一。分别在接种瘤块后第7天和第15天尾 静脉注射给药。融合蛋白(Arg)9-LDP组剂量为10mg/kg，LDM组剂量为0. 05mg/kg,融合蛋 白(Arg)9-LDP和LDM合用组，强化融合蛋白(Arg) 9_LDP_AE 3剂量组，分别为0. lmg/kg、 0. 2mg/kg和0. 3mg/kg。实验期间每隔3天测量一次肿瘤长、短径和裸鼠体重，根据公式V =ab2/2计算肿瘤体积。实验结果(图22)表明，(Arg)9-LDP-AE对神经胶质瘤细胞形成的 实体瘤有明显的抑制作用，19天时0. 2mg/kg和0. 3mg/kg剂量组的抑瘤率分别为92. 8%和 86. 2%，比力达霉素具有更显著的治疗效果，其显著差异为P < 0. 01。
权利要求
一种融合蛋白(Arg)9-LDP，其特征是所说融合蛋白由细胞穿透肽(Arg)9、力达霉素辅基蛋白LDP和羧基端的组氨酸六聚体尾组成，基因全长387bp，编码129个氨基酸。
2.一种强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE，其特征是所说强化融合蛋白由分子量为14. 5kDa 的融合蛋白(Arg)9-LDP和分子量为843Da的活化型烯二炔发色团AE构成。
3.如权利要求1所述的融合蛋白(Arg)9-LDP，其特征是其中细胞穿透肽基因全长 30bp，编码10个氨基酸，LDP基因全长330bp，编码110个氨基酸，二者之间的柔性肽基因长 3bp，编码1个氨基酸，羧基端的组氨酸六聚体尾基因长18bp，编码6个氨基酸，引入酶切位 点 6bp0
4.制备权利要求1所述融合蛋白(Arg)9-LDP的方法，其特征是所说方法主要采用DNA 重组的技术路线，具体步骤如下A.融合蛋白大肠杆茵重组表达质粒pET30-(arg)9ldp的构建；B.融合蛋白(Arg)9-LDP在保藏编号为CGMCCNo. 3815的大肠埃希氏菌中的诱导表达；C.融合蛋白(Arg)9-LDP的亲和层析纯化及分离。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是运用聚合酶链式反应扩增得到(arg)9ldp 基因，同时引入特异性酶切位点。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征是将所得到的(arg)9ldp基因克隆至质粒 pET30a中，构建重组表达质粒pET30-(arg)9ldp。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征是通过亲和层析纯化融合蛋白(Arg)9-LDP， 浓缩冻干，制备功能性融合蛋白。
8.制备权利要求2所述强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE的方法，其特征是将纯化分离得 到的融合蛋白(Arg)9-LDP与经甲醇提取制备的力达霉素活性型烯二炔发色团AE进行分子 强化，获得强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE。
9.权利要求1所述融合蛋白(Arg)9-LDP在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.如权利要求2所述强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种融合蛋白(Arg)9-LDP及其强化融合蛋白(Arg)9-LDP-AE，所说融合蛋白系由细胞穿透肽(Arg)9、力达霉素辅基蛋白LDP和羧基端的组氨酸六聚体尾组成，基因全长387bp，编码129个氨基酸；强化融合蛋白系由融合蛋白(Arg)9-LDP(分子量约为14.5kDa)和活化型烯二炔发色团AE(分子量为843Da)构成；体内、外实验结果证明，融合蛋白及其强化融合蛋白对神经胶质瘤细胞有强烈的杀伤作用，动物体内试验有显著疗效，可望开发成为临床上高效的神经胶质瘤治疗药物。
文档编号A61P35/00GK101851294SQ20101017751
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者尚伯杨, 甄永苏, 苗庆芳, 茹琴, 郑艳波 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所