一种利用基因阻断菌株制备靶向性力达霉素生产菌株的方法及其用途的制作方法

专利名称：一种利用基因阻断菌株制备靶向性力达霉素生产菌株的方法及其用途的制作方法
一种利用基因阻断菌株制备靶向性力达霉素生产菌株的方法及其用途发明领域本发明涉及一种利用基因阻断菌株制备靶向性力达霉素生产菌株的方法。具 体的，所述方法包括将包含力达霉素辅基蛋白基因与不同肿瘤靶向分子编码序列组 成之融合基因的表达质粒，导入力达霉素辅基蛋白基因阻断菌株，获得带有与所述肿 瘤靶向分子对应的靶向性之力达霉素生产菌株，其中所述基因阻断菌株是球孢链霉菌 C-1027 (Streptomyces globisporus C-1027)力达霉素辅基蛋白基因(cagA)阻断菌株球孢 链霉菌AK0(S. globisporus ΑΚ0)，所述肿瘤靶向分子包括但不限于例如肿瘤靶向抗体、肿 瘤靶向肽、细胞因子等。本发明还涉及利用所述方法获得的生产菌株生产靶向性力达霉素 的用途。
背景技术：
恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一，目前常用的治疗手段主要有手 术、放疗和化疗几种，其中化疗是最常采用的治疗策略。化疗药物可以杀死肿瘤细胞、抑 制其侵袭转移、促进肿瘤细胞的分化等，从而治疗或治愈肿瘤。其缺点是选择性差，在杀 死肿瘤细胞的同时也损伤正常细胞，出现不同程度的副作用。将化疗药物和肿瘤靶向分 子偶联制备靶向药物用于肿瘤靶向治疗具备巨大的应用价值[Dickman S，抗生素回归癌 症治疗(Antibodies stage a comeback incancer treatment)，禾斗学(Science)，1998， 280 :1196-1197]。靶向药物一般由两部分构成，一是对肿瘤细胞有杀伤能力的“弹头”；二 是有一定特异性的载体，把“弹头”药物特异性地靶向靶部位[Scallon BJ, Anyder LA, Anderson GM等人，应用于肿瘤学的抗体治疗学和与抗体相关的技术的回顾(A review of antibody therapeutics and antibody-related technologies for oncology)，免疫治疗 杂志(J. Immunother)，2006，29 (4) :351-364.]。力达霉素(又名C-1027)是由我国湖北潜江土壤中发现的球孢链霉菌 C-1027 (Streptomyces globisporus C-1027)所产生[Hu JL, XueYC, Xie MY 等人， 一种新的大分子抗肿瘤抗生素C-1027. I发现、生产菌的分类、发酵和生物学活性 (A new macromoIecuIar antitumorantibiotic，C-1027. I. Discovery, taxonomy of producingorganism, fermentation and biological activity)，抗生素杂志(J Antibiot) 东京，1988,41(11) :1575-1579] 0力达霉素是迄今为止发现的抗肿瘤活性最强的物质，比 临床上常用的阿霉素强10000倍以上[Zhen YS, Ming XY, Yu B等人，一种新的大分子抗肿 瘤抗生素 C-1027. III 抗月中瘤生物学活性(A new macromolecular antitumorantibiotic, C-1027. III. Antitumor activity),抗生素杂志(JAntibiot)东京，1989,42(8) 1294-1298]。经过十余年的新药研究和开发，目前力达霉素已经进入临床I I期研究[Shao RG, Zhen YS，烯二炔类抗肿瘤抗生素力达霉素化学，生物学和药理学(Enediyne anticancer antibiotic lidamycin :chemistry, biology and pharmacology)，Jjt 癌药物药物 U 学 (Anticancer Agents Med Chem)，2008，8 (2) : 123-131]，有望发展成为具有我国自主知识产权的新型高效的抗肿瘤药物。力达霉素属于烯二炔类抗生素，由小分子发色团和力达霉素辅基蛋白组成，发色 团具有环状烯二炔结构，是其对肿瘤细胞具有极强杀伤作用的活性中心。烯二炔类抗生素 对肿瘤细胞有很强的杀伤作用，将其作为新型抗癌药物的高效“弹头”颇具发展潜力。2001 年烯二炔类化合物卡利奇霉素(CaliCheamiCin)-CD33抗体偶联物(商品名Mylotarg)成 为第一个被FDA批准用于肿瘤治疗的单抗靶向药物[Bross PF, Beitz J，Chen G等人， 批准摘要骨髓白血病复发中的吉妥单抗(Approval summary :gemtuzumab ozogamicin in relapsedacute myeloid leukemia),临床月中瘤石if 究(Clin Cancer Res), 2001, 71490-1496]。力达霉素由于其强烈的生物活性，更适于作为抗肿瘤靶向药物的“弹头”，使 靶向药物高效化，其研究和应用展示了广阔的前景。目前常用的抗肿瘤靶向药物大多数以单克隆抗体为靶向载体，这些单克隆抗体针 对的靶标通常为肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原或特定的受体，“弹头”药物与不同的单克隆 抗体偶联可以制备差异化的单克隆抗体靶向药物。但完整单克隆抗体分子量大，应用于人 体时易产生人抗鼠抗体(HAMA)反应；穿透力低，庞大的抗体药物分子难以通过毛细管内皮 层和细胞外间隙到达实体瘤深部的肿瘤细胞。因此，研制小型化抗体药物对提高疗效有重 要意义。抗体小型化原则是在能结合抗原的前提下最小化抗体片段。研究表明，传统抗体 的结合亲和性和特异性仅在于抗体分子的前端，即重链可变区和轻链可变区结构域。随着 基因工程技术的兴起，构建小分子抗体如单链抗体(single-chain variable fragment, scFv)及单域抗体(single domain antibody)等成为现实。单链抗体和单域抗体分子质量 仅分别为完整抗体的1/6和1/12，不仅能较好地保持抗原结合能力和特异性，并且具有分 子质量小、穿透力强、半衰期短、免疫原性低、制备流程简单等特点，在肿瘤组织中具有更加 一致的生物分布，更有利于体内应用[Kasuya K, Boyer JL, Tan Y等人，腺病毒表达抗保护 的抗原单链抗体介导的炭疽毒素的被动免疫治疗(Passive immunotherapy for anthrax toxin mediated by anadenovirus expressing an antiprotective antigen single chainantibody)，分子治疗(Mol Ther)，2005，11 (2) :237-244]。因此，这些小型化的基因 工程抗体在抗肿瘤靶向药物的研发中具有广阔的应用前景。!^engqiangJ等人先后成功的以抗IV型胶原酶单克隆抗体3G11、单链抗体scFv、 单域抗体Vh及单域抗体Vd乍为靶向药物的载体，以力达霉素为弹头，制备抗体靶向性力 达霉素，不仅可以提供肿瘤靶向性，而且抗体自身就具有抑制肿瘤的效果Pengqiang W, Boyang S, Yongsu Z，力达霉素和抗IV型胶原酶单克隆抗体的分子小型化免疫偶联剂的 抗癌作用(Antitumor effects of the molecule-downsizedimmunoconjugate composed of lidamycin and Fab' fragment ofmonoclonal antibody directed against type IV collagenase)，中国科学系列 C 生命科学(Sci China C Life Sci)，2004，47 (1) :66-73.]。 实验结果表明不同的抗体靶向性力达霉素均保留了其抗原结合能力，并能抑制高转移性 PG细胞分泌的I V型胶原酶活性，抑制肿瘤细胞的侵袭能力，在体外和动物体内试验中均 获得很好的抗肿瘤效果[王风强，尚伯杨，甄永苏，抗IV型胶原酶单抗3G11与力达霉素 偶联物的抗肿瘤作用，药学学报，2003,38(7) =515-519 ；封云，甄永苏，戴垚等，不同力达 霉素与抗IV型胶原酶单抗偶联物的抗肿瘤作用，药学学报，2007,42(7) :704-709;唐勇，甄永苏，抗IV型胶原酶单链抗体的表达及其对肿瘤细胞侵袭的抑制作用，癌症，2001,20 801-805 ；Miao Q,Shang B等人，由单域抗体片段和力达霉素构成的基因工程强化融合蛋白 Vl-LDP-AE 的产生禾口抗月中瘤作用(Generation and antitumor effects of an engineered andenergized fusion protein Vl-LDP-AE composed of single-domainantibody and lidamycin)，中国科学系列 C 生命科学(Sci China SerC-Iife Sci)，2007，4 (50) 447-456]。对小型化的基因工程抗体其采取的策略是将抗体基因与力达霉素辅基蛋白基因 融合后在E. coli中表达，表达的融合蛋白scFv-LDP、Vh-LDP, Vl-LDP在体外装配力达霉素 的发色团。然而大肠杆菌所表达的融合蛋白集中在包涵体内，需在体外变性、复性后与力达 霉素拆分出的不含力达霉素辅基蛋白的发色团进行装配，工艺较复杂。李保卫等人利用基因置换技术改造力达霉素产生菌中的力达霉素生物合成基因 簇，以抗IV型胶原酶单链抗体SCFv与力达霉素辅基蛋白融合基因替代力达霉素生物合 成基因簇中的力达霉素辅基蛋白基因，构建靶向性力达霉素产生菌[李保卫，胡云峰，王丽 非等人，单链抗体与力达霉素融合蛋白在链霉菌中的表达，中国医药生物技术，2007，5 346-350]。但是，由于采用基因置换技术操作比较复杂，基因同源双交换机率较低，重组菌株 筛选工作量大，所以需要较长的时间才能得到基因正确置换的菌株，难以快速获得具有多 种不同靶向性力达霉素生产菌株。为解决不同靶向性力达霉素生产菌株的快速构建，有利 于利用所得生产菌株对相关表达产物进行生物活性分析进而用于药物研发，迫切需要一种 更简便、快速的方法用于构建可直接得到靶向性力达霉素的生产菌株。本发明人通过构建特定基因阻断菌株，将涉及复杂基因工程操作基因置换技术的 靶向性力达霉素生产菌株的制备过程简化为利用含有特定融合基因表达质粒接合转移至 基因阻断菌株的过程，大大方便了特定靶向性力达霉素生产菌株的制备。

发明内容
本发明的一个方面，涉及一种利用基因阻断菌株制备靶向性力达霉素生产菌株的 方法。具体的，本发明所述方法包括将包含力达霉素辅基蛋白基因与不同肿瘤靶向分 子编码序列组成之融合基因的表达质粒，导入力达霉素辅基蛋白基因阻断菌株，获得产生 带有与所述肿瘤靶向分子对应的靶向性之力达霉素重组菌株，其中所述基因阻断菌株是球 孢链霉菌C-1027 (Sti^ptomyces globisporus C-1027)力达霉素辅基蛋白基因(cagA)阻 断菌株球孢链霉菌AKO (S. globisporus ΑΚ0)，所述肿瘤靶向性分子包括但不限于例如肿瘤 靶向抗体、肿瘤靶向肽、细胞因子等。力达霉素辅基蛋白基因(cagA)阻断菌株的构建在本发明中，通过本领域公知的基因阻断方法，将力达霉素产生菌中所述力达霉 素辅基蛋白基因(cagA)阻断，得到力达霉素辅基蛋白基因阻断菌株球孢链霉菌ΑΚ0。力达霉素的生物合成基因簇已被克隆(GenBank登录号AY048670)，为构建力达霉 素辅基蛋白基因的阻断菌株，以及力达霉素辅基蛋白基因与肿瘤靶向分子编码序列融合基 因的遗传操作提供了有利条件。其中，力达霉素辅基蛋白基因cagA位于结构基因SgcAl和 sgcA4之间(如

图1)，cagA基因编码区全长432bp，N端编码一个33个氨基酸组成的信号肽，引导力达霉素辅基蛋白分泌至胞外，成熟力达霉素辅基蛋白CagA由110个氨基酸构成。在本发明的一个具体实施方案中，所述力达霉素辅基蛋白基因阻断菌株采用同源 重组双交换的方法，对基因簇中cagA基因进行阻断。其中，根据cagA基因上下游基因的 序列，设计引物扩增分别包含基因上游和下游的两个片段作为交换两臂，将阿普霉素抗性 基因aac (3) IV插入两臂之间，并克隆到自杀性质粒PBS03的多克隆位点，通过接合转移 导入球孢链霉菌C-1027中，通过抗性筛选获得发生双交换的接合子，然后经PCR验证和 Southern blot验证正确(如图1)，命名为球孢链霉菌ΑΚ0。力达霉素辅基蛋白基因(cagA)阻断菌株的确证分别采用如下方法对本发明所述力达霉素辅基蛋基因阻断菌株球孢链霉菌AKO 的性质加以确证
1) RT-PCR法检测球孢链霉菌AKO中cagA的表达(图2A)；2) Western blot分析检测球孢链霉菌AKO中CagA蛋白的表达(图2B)。上述两种实验结果均表明，所得cagA阻断菌株球孢链霉菌AKO不再产生力达霉素 辅基蛋白。进一步的，对球孢链霉菌AKO进行发酵研究，分别在发酵不同时间检测发酵液的 抑菌活性，球孢链霉菌AKO的发酵液在不同时间均丧失抑菌活性(如图3)。以针对力达霉 素的蛋白沉淀抽提法进行力达霉素发色团的粗提取，HPLC分析表明球孢链霉菌AKO发酵液 中检测不到力达霉素发色团(如图4)。蛋白沉淀抽提法提取力达霉素的主要原理是通过沉淀力达霉素辅基蛋白从而将 以蛋白-发色团复合物形式存在的力达霉素抽提出来，但在力达霉素辅基蛋白阻断株中已 经不再表达力达霉素辅基蛋白，蛋白沉淀法可能不能有效抽提以小分子化合物形式存在的 力达霉素发色团。因此又进一步利用发酵液直接抽提分离方法，抽提发酵液中小分子化合 物，进行质谱分析发现球孢链霉菌AKO仍可以产生发色团(如图5)。综合上述实验结果，根据本发明所构建的力达霉素辅基蛋白基因阻断株球孢链霉 菌ΑΚ0，失去了产生力达霉素辅基蛋白的能力，不能产生完整的力达霉素，但不影响发色团 的产生，为重新导入力达霉素辅基蛋白与靶向分子融合表达质粒，产生新型靶向性力达霉 素奠定了基础。为了进一步验证力达霉素辅基蛋白基因的阻断没有极性效应，并且确定利用质粒 载体导入融合蛋白基因的策略可行，本发明人进一步将力达霉素辅基蛋白基因克隆到链霉 菌表达载体上，再导入本发明所述力达霉素辅基蛋白基因阻断株球孢链霉菌AKO中进行回 复，检测回复菌株中力达霉素的产生。在本发明的一个具体实施方案中，本发明人分别采用了质粒pKC1139、pSET152 [Kieser Τ, Bibb MJ, Buttner MJ 等人，链霉菌遗传操作手册(Practical Streptomyces Genetics)诺威治(Norwich), The John Innes Foundation ;2000禾口 pL64Hong B, Phornphisutthimas S，Tilley E等人，灰色链霉菌产生链霉素可被与A-因子级联调控中 的 adpA 无关的机制所调控(Streptomycinproduction by Streptomyces griseus can be modulated by amechanism not associated with change in the adpA component ofthe Α-factor cascade)，生物技术通讯(Biotechnol Lett) 2007，29 :57-64作为载体(图 6A)。 质粒PKC1139为多拷贝质粒；质粒pSET152为整合型质粒，不含链霉菌质粒复制子，含有Φ031 attP位点，可整合到链霉菌的attB位点；质粒pL646来自pSET152，在其多克隆位 点上游引入了强启动子ermE*p和tufl基因的SD序列。将cagA基因片段与选择性抗性标记——硫链丝菌素抗性基因片段连入质粒载体 pKC1139、pSET152 和 pL646，构建了不同的 cagA 表达质粒 pKCTA900、pSETTA900、pLTA900 和 PLTA400。将不同的cagA表达质粒导入cagA阻断菌株中，发酵活性检测表明，cagA基因的 重新导入，除PLTA400外，均可使得cagA阻断菌株球孢链霉菌AKO恢复产生力达霉素的能 力，并且PKCTA900导入多拷贝的基因使产量略有提高，具有剂量效应(如图6B)，表明球孢 链霉菌AKO不产力达霉素的确是由于cagA基因阻断的结果。对导入pKCTA900的球孢链霉菌AKO进行RT-PCR和Western blot分析(如图2)， 结果均表明，cagA阻断菌株重新产生力达霉素辅基蛋白。另外，以基于力达霉素的蛋白沉 淀抽提法进行力达霉素发色团的粗提取，HPLC分析表明，在cagA阻断菌株中导入力达霉素 辅基蛋白基因，重新形成了完整的力达霉素(如图4)。以上结果表明，在力达霉素辅基蛋白阻断菌株中利用cagA表达质粒pKCTA900、 PSETTA900和pLTA900表达力达霉素辅基蛋白，可以成功实现与其合成的发色团组装成为 完整的力达霉素。这说明将具有肿瘤靶向分子(单链抗体、单域抗体、肿瘤靶向肽、细胞因 子等)编码序列与力达霉素辅基蛋白基因融合，利用上述载体导入cagA阻断株球孢链霉菌 AKO中，构建新型靶向性力达霉素产生菌株是可行的。力达霉素辅基蛋白基因与肿瘤靶向性分子融合基因的构建在本发明中，分别将力达霉素辅基蛋白基因与肿瘤靶向性分子的编码序列构建融 合基因。本发明中，所述肿瘤靶向性分子包括但不限于肿瘤靶向抗体、肿瘤靶向肽、细胞因 子，其中所述肿瘤靶向抗体可以是例如抗IV型胶原酶单域抗体Vh，所述肿瘤靶向肽可以是 例如RGD靶向肽，所述细胞因子可以是白细胞介素2 (IL-2)，以得到可在力达霉素生产菌株 中表达融合蛋白的载体。在本发明中，肿瘤靶向分子编码序列与力达霉素辅基蛋白基因融合的策略，可采 用融合于力达霉素辅基蛋白基因的C端终止密码子之前，也可融合于力达霉素辅基蛋白基 因N端信号肽编码序列之后成熟力达霉素辅基蛋白编码序列之前。在两部分之间可以直接 相融合，也可以导入连接肽，使表达的融合蛋白两部分能够保持各自的构象，力达霉素辅基 蛋白可和发色团正确结合，靶向分子可与其靶标正确结合。本发明所涉及的与力达霉素辅基蛋白融合的靶向分子的选择可有多种来源，包括 但不限于肿瘤特异性抗原的单链抗体、单域抗体、具有肿瘤特异性结合活性的小肽、细胞因 子、生长因子等。可用于本发明所述方法的单链抗体是抗体重链可变区(Vh)与轻链可变区通 过一段连接肽(linker)连接而成的一种小分子抗体，单域抗体是仅具有抗体重链可变区 (Vh)或轻链可变区单域结构的小分子抗体。此外，能够结合肿瘤细胞或肿瘤血管内皮细胞的肿瘤靶向肽也可用于构建抗肿瘤 靶向药物(详见表1)。例如，含RGD(即Arg-Gly-Asp)的小肽能够特异性地与ανβ3整合 素结合，而α νβ3整合素在很多肿瘤组织中呈高表达，并与肿瘤的侵袭转移密切相关。噬菌 体肽库技术的发展为寻找亲和力高、特异性强的肿瘤靶向肽提供了一种便捷的途径。表1.用于肿瘤靶向治疗的肿瘤靶向肽
权利要求
1.一种利用基因阻断菌株制备靶向性力达霉素生产菌株的方法，所述方法包括将包 含力达霉素辅基蛋白基因与不同肿瘤靶向分子编码序列组成之融合基因的表达质粒，导入 力达霉素辅基蛋白基因阻断菌株，获得带有与所述肿瘤靶向分子对应的靶向性之力达霉素 生产菌株。
2.权利要求1所述的方法，其中所述基因阻断菌株是力达霉素辅基蛋白基因阻断菌 株，例如力达霉素辅基蛋白基因阻断菌株球孢链霉菌ΑΚ0，保藏号CGMCC No. 3315。
3.权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤靶向分子选自肿瘤靶向抗体、肿瘤靶向肽和/ 或细胞因子。
4.权利要求3所述的方法，其中所述肿瘤靶向抗体选自单链抗体和/或单域抗体，例如 抗IV型胶原酶单域抗体VH。
5.权利要求3所述的方法，其中所述肿瘤靶向肽选自GX1、GFE-1、NGR和/或RGD靶向肽。
6.权利要求3所述的方法，其中所述细胞因子选自白细胞介素2、白细胞介素3、白细胞 介素4、白细胞介素6、白细胞介素13、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、粒细胞-巨噬细 胞集落刺激因子和/或Y干扰素诱导蛋白10。
7.一种力达霉素辅基蛋白基因阻断菌株，其为球孢链霉菌ΑΚ0，保藏号为CGMCC No.3315。
全文摘要
本发明涉及一种利用基因阻断菌株制备靶向性力达霉素生产菌株的方法。具体的，所述方法包括将包含力达霉素辅基蛋白基因与不同肿瘤靶向分子编码序列组成之融合基因的表达质粒，导入力达霉素辅基蛋白基因阻断菌株，获得带有与所述肿瘤靶向分子对应的靶向性之力达霉素生产菌株，其中所述基因阻断菌株是球孢链霉菌C-1027(Streptomyces globisporus C-1027)力达霉素辅基蛋白基因(cagA)阻断菌株球孢链霉菌AKO(S.globisporus AKO)，所述肿瘤靶向分子包括但不限于例如肿瘤靶向抗体、肿瘤靶向肽、细胞因子等。本发明还涉及利用所述方法获得的生产菌株生产靶向性力达霉素的用途。
文档编号C12R1/465GK102041268SQ200910235669
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月10日 优先权日2009年10月10日
发明者余腾斐, 崔智慧, 朱元军, 李保卫, 洪斌, 王丽非, 邵荣光 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所