一种靶向编辑gs基因的多肽及其蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种靶向编辑GS基因的多肽及蛋白。
【背景技术】
[0002] 靶向基因组编辑技术是指通过将外源序列靶向染色体特定的位点，定点改造 基因组DNA来改变基因组中的特定基因，实现定点插入一个基因或DNA元件，或将特定 基因序列敲除的目的，以便更加准确、深入地了解疾病发病机理和探究基因功能。早期 的靶向基因组编辑技术主要依赖于基因同源重组（基因打靶，gene targeting)及体细 胞核移植技术来完成对特定基因的改造，这一时期的主要技术手段包括：基因重组技术 (Recombineering)，寡核苷酸介导的基因修复（single-stranded oligonucleotides)，腺 病毒介导的革巴向基因改造（AAV-mediated gene target)的突破，是革巴向技术上的一大变 革，但这些方法总体而言存在效率低，技术要求高而且成本高的缺点，近年来，包括锌指核 酸酶（zincfinger nucleases, ZFN)在内的新的革巴向基因组编辑工具也不断被研究和开发 出来。靶向基因组编辑最重要的应用表现在，一方面可以为医学基础研究创造合适的动物 模型，另一方面还可以在工业应用上用来改良现有的宿主表达系统，比如CH0细胞，昆虫细 胞，酵母细胞等，使其更有利于工业生产需求，因此基因靶向编辑技术一直是生命科学领域 研究的热点。
[0003] 哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达 系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，因此哺乳动物细胞高效表达系统是蛋白基因表达 中研究的热点，目前研究及生产中最为常用的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞（CH0细 胞），与其他表达系统相比，它具有许多优点：①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基 化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有产物 胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；③具有重组基因的高效扩增和表达能力；④具有 贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高； ⑤CH0细胞属于成纤维细胞（fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的后 分离[申烨华等，CH0细胞表达系统研究新进展，生物工程进展，2000 (20) 4 :23-25]，其在基 因工程药物生产中得到了广泛的应用，然而，外源基因在哺乳动物细胞中的表达水平还受 到很多因素的影响，层次也很广泛，涉及复制、转录和转录后、翻译和翻译后等各级水平，因 此在各个调控水平上对CH0细胞进行改造，以获得更高效表达的CH0表达系统对于生物药 品的开发和生产而言具备十分重要的意义。
[0004] 谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS)基因是分子生物学中研究基因专一 性表达和时空表达及基因表达调控的好模式，在CH0细胞氨基酸代谢中具有重要的作用。 谷氨酰胺是细胞用来合成蛋白质的必需原料，同时它也负责细胞中氮的运输。细胞在生长 代谢中，会不断产生游离的铵离子，有研究表明过多的铵离子会严重抑制细胞的生长，引发 细胞的凋亡，从而影响蛋白的表达量。在谷氨酰胺合成酶存在下，细胞可以用铵离子和谷 氨酸来合成谷氨酰胺，同时消耗ATP，通过这个催化反应可以有效的减少铵离子的浓度。同 时，谷氨酰胺合成酶基因也是一个共扩增基因，同二氢叶酸还原酶基因（DHFR)基因一样目 前被广泛的应用在细胞筛选上作为一个筛选标记基因，含有DHFR基因的质粒可以选择性 的转入dhfr-阴性的CHO细胞如DG44、DUKXB11等中，通过筛选得到有利于蛋白药物生产的 表达系统。而GS基因由于其自身的特点，可以很好的调节细胞生长中的铵离子，简化细胞 筛选流程，有利于下游工艺的开发和优化提高，同时GS基因演化的表达系统作为选择标记 基因具有比DHFR相对更高的严谨度和扩增效率，因此一般可以不需要多步加压就能获得 高产细胞，比DHFR系统具有省时，减少人力和耗材等优点，LONZA公司最先开发出GS表达 系统，其宿主细胞CHO为CH0K1SV，然而其需要额外添加外源的硫氨甲硫氨酸（MSX)抑制剂 进行筛选。这在一定程度上降低了该系统筛选的严谨性，因此如何靶向改造 CHO细胞中的 GS系统，获得能够更为高效、严谨进行表达的CHO细胞对于本领域技术人员而言是一个亟 待解决的问题。
【发明内容】
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供一对短肽，其能够高效的、特异性的识别CH0细 胞GS基因上的两段相邻的核苷酸序列，从而准确、高效的针对CH0细胞中GS基因进行靶向 编辑。
[0006] 所述的一对短肽的核苷酸碱基编码序列分别如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示。
[0007] 所述的一对短肽氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示。
[0008] 所述一对短肽的核苷酸靶向结合的靶点序列分别如SEQ ID NO. 13和SEQ ID Ν0· 14所示。
[0009] 本发明还进一步提供包含一对多核苷酸中的任意一条多核苷酸的载体。
[0010] 上述载体优选为包含F0KI片段的载体，进一步优选为包含F0KI片段的pCMV-HA、 pCI-neo、pIRESneo、pCAGGS、pCDNA3. 1 或 pCS2-F0KI，更优选为 pCAGGS，pCDNA3. 1， PCS2-F0KI，最优选为 pCS2-F0KI。
[0011] 上述包含一对多核苷酸中的任意一条多核苷酸的载体的制备方法为，将一条多核 苷酸序列先连接到中间载体上，然后再连接到具有真核启动子和终止子的载体中得到。
[0012] 其中所述中间载体为pUC57、pUC18、pUC19或pMD-TALE，优选为pUC18或 pMD-TALE，进一步优选为 pMD-TALE。
[0013] 本发明还进一步提供包含上述载体的宿主细胞。
[0014] 所述宿主细胞为CH0细胞或CH0来源的其它变种细胞，优选为CH0-S、DG44或 CH0-Kl〇
[0015] 本发明还提供上述融合蛋白和其相应编码核苷酸序列在宿主细胞靶向修饰GS基 因的方法，其步骤为：将上述一对融合蛋白或者所述的一对多核苷酸序列或者含有序列的 载体转入宿主细胞中，于37°C培养2-3天，得到内源GS基因被靶向修饰的细胞。
[0016] 本发明中提供的序列具有高效识别靶点，特异性强，准确度高等优点。进一步地， 通过本申请中的多肽及靶向修饰基因方法获得的细胞株可以应用于工业化生产，通过以GS 为筛选标记的真核表达载体进行外源蛋白的稳定、高产单克隆的快速筛选。
【附图说明】
[0017] 图1为实施例3中靶点1TALEN质粒对细胞活性酶切结果，其中1为CH0-S细胞未 转染基因组PCR产物条带；2为CH0-S细胞转染后基因组PCR产物进行Apal过夜酶切后条 带。
[0018] 图2为实施例3中靶点2TALEN质粒对细胞活性酶切结果，其中1为DL2000对照 marker，2为CH0-S细胞转染后基因组PCR产物进行Avail过夜酶切后条带，3为CH0-S细 胞未转染基因组PCR产物条带。
[0019] 图3为实施例3中靶点3TALEN质粒对细胞活性酶切结果，其中1为CH0-S细胞未 转染基因组PCR产物条带，2为CH0-S细胞转染后基因组PCR产物进行BseYI过夜酶切后条 带，3 为 DL2000 对照 marker。
[0020] 图4为实施例3中靶点1未切开的PCR片段测序结果
[0021] 图5为实施例4中转染后CH0-S细胞中GS蛋白WesternBlot检测结果，其中 Marker为蛋白Marker，1-7为待测CH0-S细胞中GS蛋白表达结果，CH0-S为正常细胞中GS 蛋白表达条带
[0022] 图6为实施例5中转染后DG44细胞中GS蛋白WesternBlot检测结果，其中Marker 为蛋白Marker，1-5为待测DG44细胞中GS蛋白表达结果，DG44为正常细胞中GS蛋白表达 条带
[0023] 图7为实施例5中转染后CH0-K1细胞中GS蛋白WesternBlot检测结果，其中 Marker为蛋白Marker，1-3为待测CH0-K1细胞中GS蛋白表达结果，CH0-K1为正常细胞中 GS蛋白表达条带
【具体实施方式】
[0024] 以下实施例是对本发明的进一步解释，不能限制本发明的保护范围。根据本领域 公知