采用寡核苷酸介导的基因修复提高靶向基因修饰的效率的方法和组合物的制作方法
【专利说明】采用寡核苷酸介导的基因修复提高靶向基因修饰的效率的 方法和组合物
[0001] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/801，320的优先权， 所述专利申请特此以引用的方式并入。 发明领域
[0002] 本发明总体上涉及用于改进对基因组或其他核苷酸序列中的特定位置的修饰的 靶向效率的新颖方法。另外，本发明涉及已经通过本文所公开的方法修饰、突变或标记的靶 DNA。本发明还涉及已经通过本发明的方法修饰的细胞、组织和生物体。
[0003] 发明背景
[0004] DNA双链断裂（DSB)增强在活细胞中的同源重组并且已经用于通过使用工程化核 酸内切酶靶向基因组编辑。工程化核酸酶的关键组分是DNA识别结构域，所述结构域能够 将核酸酶引导至基因组的靶位点以用于基因组DNA双链断裂。由于非同源末端连接（NHEJ) 所致的细胞DSB修复导致靶基因的诱变缺失/插入。或者，DSB可刺激内源性靶基因座与 具有所需遗传信息的外源引入的同源DNA片段之间的同源重组，这是被称为基因靶向的一 个过程。
[0005] 涉及基因或基因组编辑的最有希望的方法是定制设计的锌指核酸酶（ZFN)，其是 由锌指蛋白的DNA结合结构域和FokI核酸酶结构域（FN)组成的一种类型的杂交酶。ZFN 技术主要涉及使用来源于锌指（ZF)蛋白的DNA结合结构域与核酸内切酶FokI的非特异性 裂解结构域的杂合蛋白。ZF可被组装为进行定制设计以在于预先选定位点结合之后识别选 定DNA序列的模块，DSB通过FokI的裂解结构域的作用产生。
[0006] 首先从细菌海床黄杆菌分离FokI核酸内切酶。这种IIS型核酸酶由两个独立的 结构域组成，N末端DNA结合结构域和C末端DNA裂解结构域。DNA结合结构域的功能是用 于识别非回文序列5' -GGATG-375' -CATCC-3'，而催化结构域在所述识别位点下游9和13个 核苷酸的固定距离处非特异性地裂解双链DNA。FokI作为无活性单体存在于溶液中，并且 在结合其靶DNA且在一些二价金属的存在下变成活性二聚体。作为功能性复合物，FokI的 各自结合双链DNA分子的两个分子通过DNA催化结构域二聚化以用于有效裂解DNA双链。
[0007] 以类似的方式，还可通过使用其他蛋白质/结构域制备核酸酶，如果所述蛋白质/ 结构域能够特异性DNA识别。TAL效应子属于细菌蛋白的一大群体，其存在于黄单胞菌属的 不同菌株中并且通过III型分泌系统（所谓的III型效应子）易位至宿主细胞中。一旦在宿 主细胞中，一些TAL效应子已被发现针对菌株毒力（引起疾病的能力）或无毒力（触发宿 主抗性反应的能力）转录活化其对应宿主靶基因，这取决于宿主遗传背景。每个效应子包 含为真核转录活化因子的特征的功能性核定位基序和有效转录活化结构域。并且每个效应 子还含有由34个氨基酸的不同数目的重复单位组成的中心重复区域，且作为DNA结合结构 域的重复区域决定每个效应子的生物学特异性。
[0008] Zhang等，Plant Physiol. 161:20-27, 2013(其以引用的方式整体并入本文）公 开了使用TALEN(转录活化因子样效应子核酸酶），其是基于TAL效应子样DNA结合结构域 与FokI的催化结构域的组合的工程化的核酸内切酶。通过工程化DNA结合结构域，这些 TALEN据报道可容易地设计来识别特异性DNA结合结构域。使用烟草原生质体作为模型系 统，使用包含连接至TALEN识别位点的黄色荧光蛋白编码序列的单链退火多核苷酸报道基 因评定TALEN活性。将此报道基因系统递送至原生质体，并且可通过功能性YFP的表达来 测量裂解和修复事件。
[0009] 发明概述
[0010] 在第一方面，本发明涉及用于将基因修复寡核碱基（GRON)介导的突变引入至植 物细胞中的靶脱氧核糖核酸（DNA)序列中的方法。所述方法尤其包括在将GRON递送至植 物细胞中之前和/或同时在增加一种或多种细胞DNA修复过程的条件下培养植物细胞。
[0011] 在某些实施方案中，增加一种或多种细胞DNA修复过程的条件包括以下中的一种 或多种：将一个或多个位点引入至GRON中或至植物细胞DNA中，所述位点是用于碱基切除 修复的靶标；将一个或多个位点引入至GRON中或至植物细胞DNA中，所述位点是用于非同 源末端连接的靶标；将一个或多个位点引入至GRON中或至植物细胞DNA中，所述位点是用 于微同源介导的末端连接的靶标；将一个或多个位点引入至GRON中或至植物细胞DNA中， 所述位点是用于同源重组的靶标；以及将一个或多个位点引入至GRON中或至植物细胞DNA 中，所述位点是用于推动修复的靶标。
[0012] 在某些实施方案中，靶脱氧核糖核酸（DNA)序列是在植物细胞基因组内。植物细 胞可以是非转基因或转基因的，并且靶DNA序列可以是所述植物细胞的转基因或内源基 因。
[0013] 在某些实施方案中，增加一种或多种细胞DNA修复过程的条件包括引入一种或多 种化合物，所述化合物在将GRON递送至植物细胞中之前或同时将单或双DNA链断裂引入至 植物细胞中。示例性化合物在下文描述。
[0014] 本文所述的方法和组合物适用于一般植物。仅作为举例，植物物种可选自由以下 组成的组：芥花、向日葵、玉米、烟草、甜菜、棉花、玉米、小麦、大麦、水稻、苜蓿（alfafa)、大 麦、高粱、西红柿、芒果、桃子、苹果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、土豆、胡萝卜、莴苣、洋葱、大豆、 大豆属、甘蔗、豌豆、鹰嘴豆、紫花豌豆（field bean)、蚕豆、扁豆、萝卜、芜菁甘蓝、球芽甘 蓝（brussel sprouts)、羽扇豆、花椰菜、羽衣甘蓝、菜豆、杨树、松树、桉树、葡萄、柑橘、黑 小麦、苜蓿、黑麦、燕麦、草皮和牧草、亚麻、油菜、芥菜、黄瓜、牵牛花、香脂、辣椒、茄子、万寿 菊、莲花、卷心菜、菊花、康乃馨、郁金香、鸢尾以及百合。这些还可全部或部分地适用于所有 其他生物系统，包括但不限于细菌、真菌和哺乳动物细胞以及甚至其细胞器（例如，线粒体 和叶绿体）。
[0015] 在某些实施方案中，所述方法还包括从植物细胞再生具有通过GRON引入的突变 的植物，并且可包括从所述植物采集种子。
[0016] 在相关方面，本发明涉及包含根据本文所述的方法通过GRON引入的基因组修饰 的植物细胞，包含根据本文所述的方法通过GRON引入的基因组修饰的植物，或包含根据本 文所述的方法通过GRON引入的基因组修饰的种子。
[0017] 本发明的其他实施方案将是从以下详述、示例性实施方案和权利要求书显而易见 的。
[0018] 发明详述
[0019] 定义
[0020] 根据以下定义来理解本发明。
[0021] 寡核碱基是核碱基的聚合物，所述聚合物可通过沃森-克里克（Watson-Crick)碱 基配对与具有互补序列的DNA杂交。
[0022] 核碱基包含碱基，其是嘌呤、嘧啶或其衍生物或类似物。核碱基包括肽核碱基、肽 核酸的亚基和吗啉核碱基以及核苷和核苷酸。核苷是含有戊呋喃糖基部分的核碱基，例如， 任选取代的核糖核苷或2' -脱氧核糖核苷。核苷可通过一些键联部分中的一种连接，所述 连接部分可能含磷或不含磷。通过未取代的磷酸二酯键连接的核苷被称为核苷酸。
[0023] 寡核碱基链具有单个5'和3'端，其是聚合物的最终核碱基。特殊的寡核碱基链 可含有所有类型的核碱基。寡核碱基化合物是含有一个或多个为互补的且通过沃森-克里 克碱基配对杂交的寡核碱基链的化合物。核碱基是脱氧核糖型或核糖型。核糖型核碱基是 含有戊咲喃糖基的核喊基，其中2'碳是被羟基、烷氧基或卤素取代的亚甲基。脱氧核糖型 核碱基是不同于核糖型核碱基的核碱基且包括所有不含有戊呋喃糖基部分的核碱基。
[0024] 寡核碱基链一般包括寡核碱基链和寡核碱基链的区段或区域两者。寡核碱基链具 有3'端和5'端。当寡核碱基链与一条链同延时，所述链的3'和5'端也是所述链的3'和 5，末端。
[0025] 根据本发明，植物器官包括但不限于叶、茎、根、叶芽、花芽、分生组织、胚芽、子叶、 胚乳、萼片、花瓣、雌蕊、心皮、雄蕊、花药、小孢子、花粉、花粉管、胚珠、子房和果实或从其取 得的切片、薄片或盘。植物组织包括但不限于愈伤组织、基本组织、维管组织、贮藏组织、分 生组织、叶片组织、茎组织、根组织、冠癭组织、植物肿瘤组织以及再生组织。植物细胞包括 但不限于具有细胞壁的分离的细胞、其各种大小的聚集体以及原生质体。
[0026] 当如下所述针对最大对应性进行比对时，如果两个多核苷酸或多肽序列中相应地 核苷酸或氨基酸残基的序列相同时，则两个多核苷酸或多肽是相同的。在两个或更多个核 酸或多肽序列的背景下，术语"相同的"或"同一性百分比"是指当在比较窗上针对最大对 应性比较和比对时，如使用以下序列比较算法中的一种或通过人工比对和目视检查所测 量，两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸。对于 序列在保守取代方面不同的多肽来说，序列同一性百分比可向上调整以校正取代的保守性 质。用于进行这种调整的手段是本领域的技术人员熟知的。通常这涉及将保守性取代评分 为部分而不是完全错配，从而增加序列同一性百分比因此，例如，在相同氨基酸被给予得分 1并且非保守性取代被给予得分零的情况下，保守性取代被给与零与1之间的得分。根据例 如 Meyers&Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17 (1988)的算法，例如如在程序 PC/ GENEQntelligenetics, Mountain View, Calif. ,USA)中所实施来计算保守性取代的得分。
[0027] 在两个核酸或多肽的背景下，术语"基本上相同的"和"同一性百分比"是指当在 比较窗上针对最大对应性进行比对时，如使用以下序列比较算法中的一种或通过人工比对 和目视检查所测量，具有至少50 %、有利地60 %、优选地70 %、更优选地80 %且最优先地 90% -95%核苷酸或氨基酸残基同一性的序列或子序列。当测试序列与参考序列具有实质 同一性时，此定义还指测试序列的具有实质序列或子序列互补性的互补序列。
[0028] 本领域的技术人员将认识到如果两个多肽是免疫上类似的，则两个多肽也可以是 "基本上相同的"。因此，当两个多肽的一级结构展示显著变异时，总体蛋白质结构可以是类 似的。因此，测量两个多肽是否是基本上相同的方法涉及测量单克隆或多克隆抗体与每个 多肽的结合。如果对于第一多肽具有特异性的抗体以针对第一多肽的亲和力的至少三分之 一的亲和力结合第二多肽，则两个多肽是基本上相同的。对于序列比较来说，通常一个序列 充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输 入计算机中，指定子序列坐标（如果需要），并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算 法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
[0029] 可例如通过以下方法来进行序列的最佳比对以供比较，例如Smith和 Waterman, 0.4dv. Appl. Math. 2:482(1 98 I)的局部同源性算法；Needleman 和 Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)的同