0789、US 6,870,075 以及美 国公布专利申请20030084473(其各自特此整体并入）公开了可用于本发明的另外重组基 因分子。术语"重组基因寡核碱基"在本文用于指代可用于本发明的方法中的分子，并且包 括混合双链寡核苷酸、在Kmiec II中教导的含有非核苷酸的分子、单股寡脱氧核苷酸以及 在以上提及的专利和专利公布中教导的其他重组基因分子。
[0046] 在一个实施方案中，重组基因寡核碱基是混合双链寡核苷酸，其中混合双链寡核 苷酸的RNA型核苷酸通过用氟、氯或溴官能团置换2' -羟基或通过在2' -0上安置取代基而 成为核糖核酸酶（RNase)抗性的。适合的取代基包括Kmiec II中教导的取代基。替代取 代基包括美国专利号5, 334, 711 (Sproat)教导的取代基和专利公布EP 629 387和EP 679 657(总称Martin申请案）教导的取代基，其以引用的方式并入本文。如本文所用，核糖核 苷酸的2' -氟、2' -氯或2' -溴衍生物或者其2' -OH被Martin申请案或Sproat中所述的取 代基取代的核糖核苷酸被称为"2' -取代的核糖核苷酸"。本文所用，术语"RNA型核苷酸" 意指通过未取代的磷酸二酯键联或由Kmiec I或Kmiec II教导的任何非天然键联与混合 双链寡核苷酸的其他核苷酸连接的2' -羟基或2' -取代的核苷酸。如本文所用，术语"脱氧 核糖型核苷酸"意指具有2' -H的核苷酸，其可通过未取代的磷酸二酯键联或由Kmiec I或 Kmiec II教导的任何非天然键联与MDON的其他核苷酸连接。
[0047] 在本发明的一个实施方案中，重组基因寡核碱基是单独通过未取代的磷酸二酯键 连接的混合双链寡核苷酸。在替代实施方案中，通过由Kmiec II教导的取代的磷酸二酯、磷 酸二酯衍生物和无磷基键联进行连接。在又一个实施方案中，混合双链寡核苷酸中的每个 RNA型核苷酸是2' -取代的核苷酸。2' -取代的核糖核苷酸的特别优选实施方案是2' -氟、 2' -甲氧基、2' -丙氧基、2' -烯丙氧基、2' -羟乙氧基、2' -甲氧基乙氧基、2' -氟丙氧基和 2' -三氟丙氧基取代的核糖核苷酸。2' -取代的核糖核苷酸的更优选的实施方案是2' -氟、 2' -甲氧基、2' -甲氧基乙氧基和2' -烯丙氧基取代的核苷酸。在另一个实施方案中，混合 双链寡核苷酸通过未取代的磷酸二酯键连接。
[0048] 虽然仅具有单一类型的2' -取代的RNA型核苷酸的混合双链寡核苷酸更方便合 成，但本发明的方法仍可用具有两种或更多种类型的RNA型核苷酸的混合双链寡核苷酸实 践。由在两个RNA型三核苷酸之间引入脱氧核苷酸引起的中断可能不会影响RNA区段的功 能，因此，术语RNA区段涵盖如"中断的RNA区段"。未中断的RNA区段被称为连续RNA区 段。在一个替代实施方案中，RNA区段可含有交替的抗RNA酶核苷酸和未取代的2' -OH核 苷酸。混合双链寡核苷酸优选地具有少于100个核苷酸且更优选地少于85个核苷酸、但多 于50个核苷酸。第一条链和第二条链进行沃森-克里克碱基配对。在一个实施方案中，混 合双链寡核苷酸的链通过接头如单链六、五或四核苷酸共价键合，以使得第一条链和第二 条链是具有单个3'端和单个5'端的寡核苷酸单链的区段。通过添加"发夹帽"可保护3' 端和5'端，借此3'端和5'端核苷酸与邻近核苷酸进行沃森-克里克配对。另外，可在远 离3'端和5'端的第一条链与第二条链之间的接点处安置第二发夹帽，以使得第一条链和 第二条链之间的沃森-克里克配对稳定。
[0049] 第一条链和第二条链含有与靶ACC酶基因的两个片段同源的两个区域，即，具有 与靶基因相同的序列。同源区含有RNA区段的核苷酸，并且可含有连接DNA区段的一种或多 种DNA型核苷酸，并且还可含有不在插入DNA区段内的DNA型核苷酸。具有同源性的两个区 域被一个区域分开且各自与所述区域相邻，所述区域具有与靶基因的序列不同的序列，被 称为"异源区"。异源区可含有一个、两个或三个错配的核苷酸。错配的核苷酸可以是连续 的或者可替代地被与靶基因同源的一个或两个核苷酸分开。或者，异源区还可含有插入或 一个、两个、三个或五个或更少的核苷酸。或者，混合双链寡核苷酸的序列可能与靶基因序 列不同，差别在于从混合双链寡核苷酸中缺失一个、两个、三个或五个或更少的核苷酸。在 这种情况下，异源区的长度和位置被视为缺失的长度，即使没有混合双链寡核苷酸的核苷 酸在异源区内。当意图一个或多个取代时，与两个同源区互补的靶基因片段之间的距离与 异源区的长度相同。当异源区含有插入时，同源区在混合双链寡核苷酸中分开的距离因而 比其互补同源片段在基因中分开的距离要远，而当异源区编码缺失时情况相反。
[0050] 混合双链寡核苷酸的RNA区段各自是同源区的一部分，即，序列中与靶基因的片 段相同的区域，其区段一起优选含有至少13个RNA型核苷酸且优选16至25个RNA型核苷 酸或更优选18-22个RNA型核苷酸或最优选20个核苷酸。在一个实施方案中，同源区的 RNA区段被插入DNA区段分开且与其相邻，即，由插入DNA片区段"连接"。在一个实施方案 中，异源区的每个核苷酸是插入DNA区段的核苷酸。含有混合双链寡核苷酸的异源区的插 入DNA区段被称为"突变区段（mutator segment)"。
[0051] 待引入靶基因中的变化由异源区编码。待引入基因中的变化可以是将所述位置中 的天然氨基酸改变成所需氨基酸的基因序列的一个或多个碱基中的变化。
[0052] 在本发明的另一个实施方案中，重组基因寡核碱基是单链寡脱氧核苷酸突变载 体或SS0MV，其公开于国际专利申请PCT/US00/23457中，其以引用的方式整体并入本文。 SSOMV 的序列与美国专利号 5, 756, 325 ;5, 871，984 ;5, 760, 012 ;5, 888, 983 ;5, 795, 972 ; 5, 780, 296 ;5, 945, 339 ;6, 004, 804 和 6, 010, 907 以及国际公布号 TO 98/49350 ;W0 99/07865 ;W0 99/58723 ;W0 99/58702 ;W0 99/40789 ;US 6,870,075 ;以及美国公布专利申 请20030084473中描述的突变载体基于相同的原理。SSOMV的序列含有与靶序列同源、被一 个区域分开的两个区域，所述区域含有所需的遗传改变，其被称为突变区。突变区可具有与 靶序列中分开同源区的序列相同长度的序列，但是具有不同的序列。这样的突变区将引起 取代。
[0053] SSOMV的核苷酸是通过未修饰的磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸，除了 3'末端 和/或5'末端核苷酸间键联或者可替代地两个3'末端和/或5'末端核苷酸间键联可以 是硫代磷酸酯或氨基磷酸酯。如本文所用，核苷酸间键联是SSOMV的核苷酸之间的键联，并 且不包括3'端核苷酸或5'端核苷酸与封闭取代基之间的键联，参见上文。在一个具体的 实施方案中，SSOMV的长度在21与55个脱氧核苷酸之间，并且相应地，同源区的长度具有 至少20个脱氧核苷酸的总长度且至少两个同源区应各自具有至少8个脱氧核苷酸的长度。
[0054] SSOMV可被设计为与靶基因的编码链或非编码链互补。当所需的突变是单碱基取 代时，优选突变核苷酸是嘧啶。在与实现所需的功能结果一致的程度上，优选突变核苷酸和 互补链中的靶核苷酸都是嘧啶。特别优选是编码颠换突变的SSOMV，即，C或T突变核苷酸 分别与互补链中的C或T核苷酸错配。
[0055] 除了寡脱氧核苷酸，SSOMV还可含有5'封闭取代基，其通过接头连接至5'末端 碳。接头的化学结构并不重要，除了它的长度，长度优选应为至少6个原子长，且接头应 当灵活。可使用多种无毒取代基，如生物素、胆固醇或其他类固醇或非嵌入的阳离子荧 光染料。特别优选的作为制造 SSOMV的试剂是由Glen Research, Sterling VA(现在GE Healthcare)作为Cy3?和Cy5 ?销售的试剂，所述试剂是封闭的亚磷酰胺，其并入寡核苷酸 后分别产生3, 3, 3'，3' -四甲基Ν，Ν' -异丙基取代的吲哚单碳菁染料和吲哚二碳菁染料。 Cy3是最优选的。当吲哚碳菁是N-氧基烷基取代的时，其可通过具有5'端磷酸酯的磷酸 二酯，方便地与寡脱氧核苷酸的5'末端连接。染料与寡脱氧核苷酸之间的染料接头的化 学并不重要，并且其选择是为了合成方便。当直接使用可商购的Cy3亚磷酰胺时，所得的 5'修饰包括封闭取代基和接头，所述封闭取代基和接头一起是N-羟丙基、Ν' -磷脂酰丙基 3, 3, 3'，3'-四甲基吲哚单碳菁。
[0056] 在一个优选实施方案中，吲哚碳菁染料在吲哚环的3和3'位置被四次取代。不 受理论的限制，这些取代防止染料变成嵌入染料。在这些位置处的取代基的身份不重要。 SSOMV还可具有3'封闭取代基。同样，3'封闭取代基的化学不重要。
[0057] 在另一个优选的实施方案中，重组基因寡核苷酸是单链寡脱氧核苷酸，其具有3' 端核苷酸、5'端核苷酸、具有至少25个脱氧核苷酸且不超过65个脱氧核苷酸，并且具有包 含各自至少8个脱氧核苷酸的至少两个区的序列，所述区各自分别与靶向染色体基因的至 少两个区相同，所述区一起是至少24个核苷酸长，并且所述区由靶向染色体基因的序列中 或寡脱氧核苷酸的序列中或两者中的至少一个核苷酸分开，以使得寡脱氧核苷酸的序列与 靶向染色体基因的序列不相同。参见美国专利6, 271，360,其以引用的方式并入本文。
[0058] 微载体和微纤维
[0059] 用于通过射弹穿透将DNA的较大片段引入具有纤维素细胞壁的植物细胞中的金 属微载体（微球体）的使用是相关领域的技术人员所熟知的（自此生物射弹递送）。美国 专利号4, 945, 050 ;5, 100, 792和5, 204, 253描述用于选择用于发射它们的微载体和装置的 一般技术。美国专利号5, 484, 956和5, 489, 520描述使用玉米愈伤组织的微弹轰击来制备 可育转基因玉米。生物射弹技术还用于转化不成熟的玉米胚芽。
[0060] 在本发明的方法中使用微载体的具体条件描述于国际公布WO 99/07865中。在 说明性技术中，按顺序添加冰冷的微载体（60mg/ml)、混合双链寡核苷酸（60mg/ml)、2. 5M CaCljP 0.1 M亚精胺；例如通过涡旋轻轻搅拌混合物10分钟，并且然后在室温下静置10 分钟，随后将微载体在5体积的乙醇中稀释，离心并重悬于100%乙醇中。在粘附溶液使用 8-10 μ g/ μ 1微载体、14-17 μ g/ μ 1混合双链寡核苷酸、1. 1-1. 4M CaCjP 18-22mM亚精胺 的浓度可获得良好结果。在8 μ g/ μ 1微载体、16. 5 μ g/ml混合双链寡核苷酸、I. 3M CaCl 和21mM亚精胺的条件下观察到最佳结果。
[0061] 还可使用微纤维将重组基因寡核碱基引入用于实践本发明的植物细胞中以穿透 细胞壁和细胞膜。Coffee等的美国专利号5, 302, 523描述使用30X0. 5 μπι和10X0. 3 μπι 碳化硅纤维来促进黑色墨西哥甜的玉米悬浮培养物的转化。可用于使用微纤维引入用于 植物细胞转化的DNA的任何机械技术可用于递送用于制备本发明的ACC酶突变体的重组 基因寡核碱基。用于重组基因寡核碱基的微纤维递送的示例