一种靶向抑制PRDX5基因表达的shRNA的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种靶向抑制PRDX5基因表达的shRNA，由正义链和反义链组成，其特征在于，所述正义链包含SEQ ID NO:1所示序列，所述反义链包含SEQ ID NO:1所示序列的互补序列，所述PRDX5的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述PRDX5的基因编码序列如SEQ ID NO:3所示。所述shRNA可用于治疗癌症，例如胃癌。本发明还涉及包含所述shRNA的抗癌药物组合物。
【专利说明】
一种靶向抑制PRDX5基因表达的shRNA
技术领域
[0001 ] 本发明涉及癌症治疗领域，更特别地，涉及一种治疗癌症的shRNA。
【背景技术】
[0002] 我国是胃癌高发国家，其发病率和致死率分别高居全部恶性肿瘤的第3位和第2 位。由于胃癌起病隐匿，早期多无明显症状，不易觉察，使得胃癌的早期发现非常困难。特别 是在我国，超过80%的胃癌在确诊时就已处于进展期，预后很差，严重威胁着人们的生命健 康。因此需要一种有效的药物治疗胃癌。
[0003] 氧化应激是指环境或细胞线粒体功能障碍等因素导致体内活性氧簇(reactive oxygen species，R0S)如超氧阴离子、轻自由基、过氧化氢产生过多，氧化系统和抗氧化系 统失衡，从而导致组织损伤。体内存在抗氧化酶如超氧化物歧化酶（s u p e r ο X i d e dismutase，SOD)、过氧化氢酶（catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GST_Px)、过氧化物酶类(peroxiredoxins，PRDXs)等调节氧化应激反应。低浓 度R0S可促进细胞增殖和分化，高浓度R0S则诱导细胞凋亡。
[0004]氧化应激和线粒体功能障碍之间有着紧密的相关联系。氧化应激加重线粒体功能 障碍，而线粒体功能障碍又增加 R0S的产生，形成增强氧化应激的恶性循环。通过肿瘤线粒 体蛋白质组分析，发现很多抗氧化损伤相关的蛋白（包括CAT、PRDX3和PRDX5等)表达增高。 PRDXs是一类能降低R0S产生的抗氧化蛋白，能够增加细胞在氧化应激压力下存活和增殖能 力，其表达水平与一些肿瘤如甲状腺癌、乳腺癌和肺癌相关。而PRDX5在对抗R0S方面比其他 PRDXs更为有效，它能保护线粒体和核内DNA的损伤，降低其表达水平使得细胞易于凋亡。现 在关于PRDX5和胃癌的关系，研究还非常少。
[0005] 本发明将PRDX5基因及蛋白的表达检测引入胃癌诊断中应用，并设计特异性shRNA 针对PRDX5进行靶向阻断，研究结果具有理论创新特点和较大的现实意义，本发明将为胃癌 的特异性、灵敏性的早期诊治提供帮助。同时也为靶向调节氧化应激相关蛋白的抗肿瘤治 疗研究和病例筛选提供重要参考。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了 一种靶向抑制PRDX5基因表达的shRNA，包含5 '端的正义框和3 '端的 反义框，所述正义框的序列如SEQ ID NO: 1所示，并且所述反义框的序列为SEQ ID NO: 1所 示序列的互补序列，所述PRDX5的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述PRDX5的基因编码序 列如SEQ ID N0:3所示。
[0007] 优选地，所述正义框与所述反义框之间有3-10个核苷酸的间隔，所述3-10个核苷 酸至少部分不互补，以形成发卡环。
[0008] 优选地，所述反义框的3'末端附接了两个或更多个尿苷。
[0009] 优选地，所述shRNA的序列如SEQ ID N0:4所示。所述shRNA可用于制备抗癌药物。 [0010] 本发明还提供了一种DNA载体，其包含上述shRNA的DNA编码序列，以及驱动所述 DNA编码序列转录的启动子，所述DNA编码序列顺着所述启动子的转录方向有效连接于所述 启动子的下游。
[0011]优选地，所述启动子是能在人的细胞中组成型表达的启动子。
[0012]所述DNA载体可用于制备抗癌药物，例如，用于治疗胃癌。
[0013]本发明还公开了一种抗癌药物组合物，其包含上述shRNA和/或DNA载体，以及药学 可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、佐剂中一种或多种的组合。
[0014]优选地，所述药物组合物用于治疗胃癌。
【附图说明】
[0015] 图1为检测PRDX5-shRNA抑制PRDX5蛋白水平的Western blot图；
[0016] 图2为检测PRDX5-shRNA抑制PRDX5转录水平的Q-PCR的结果图；
[0017] 图3为PRDX5-shRNA抑制癌细胞增殖的统计图。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合具体实例和附图对本发明的原理和特征进行进一步描述，所举实例只用 于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0019] 发明人在研究胃癌的过程中，通过线性轨道离子阱色谱-质谱技术分析胃癌患者 和健康者的组织样本，发现PRDX5蛋白水平在胃癌患者的组织样本中升高3倍，因此预测 PRDX5蛋白在胃癌肿瘤的发展过程中起重要作用。发明人根据PRDX5蛋白的cDNA序列设计 shRNA，以研究该shRNA与PRDX5的表达水平，以及对肿瘤的影响。出乎意料地，发明人发现该 shRNA具有抗癌作用。
[0020] 实施例lPRDX5-shRNA的制备
[0021] 本实施例的靶向抑制PRDX5表达水平的shRNA根据PRDX5的cDNA序列设计，并通过 人工合成的方法分别合成 5'_CACCGCCTGGCACCCAATATCATCTTTCAAGAGAAGATGATATTGGGTGCCA GGCTTTTTTG-3 ' 和5 '-GATCCAAAAAAGCCTGGCACCCAATATCATCTTCTCTTGAAAGATGATATTGGGTGCCA GGC。将两条链等比例混合，退火后得到双链顺着启动子的转录方向连接于表达载体中，通 过该表达载体表达得到 RNA，其序列为5 ' -GCCUGGCACCCAAUAUCAUCUUUCAAGAGAAGAUGAUAUUGG GUGCCAGGCUU-3'（SEQ ID N0:4)，该RNA链内退火得到PRDX5-shRNA:
[0023] 实施例2shRNA在胃癌细胞中对PRDX5表达的抑制
[0024]通过脂质体转染法将上述shRNA转染至胃癌细胞SGC7901中，挑选转染子进行培 养，通过Western blot和Q-PCR分别从蛋白水平和转录水平来检测转染子中PRDX5的表达情 况，以乱序的对照shRNA为阴性对照。
[0025] 结果如图1和图2所示，转染了PRDX5-shRNA的胃癌细胞SGC7901的PRDX5无论是在 蛋白水平（图1)还是在转录水平（图2)都显著低于对照，这提示，PRDX5-shRNA显著抑制了癌 细胞中PRDX5的表达。
[0026]实施例3shRNA抑制胃癌细胞的增殖
[0027]在72小时内实时监测上述胃癌细胞转染子的细胞增殖状况，与对照shRNA进行对 比，得到图3。结果显示，PRDX5-shRNA能够显著抑制癌细胞的增殖。
[0028] 实施例4shRNA对抑制肿瘤SGC7901的生长抑制作用
[0029] 选取体重为18-22g的雌性BALB/c裸鼠2只以建立移植瘤模型，将人胃癌SGC7901细 胞接种于裸鼠腋窝皮下，每只接种2X106个细胞。待瘤块体积约100mm3大小时，将裸鼠按照 瘤块大小和体重进行分为3组，每组6只裸鼠。生理盐水组、阴性对照-shRNA(shNC)组和 PRDX5-shRNA组，每周三次，瘤内注射，连续给药两周。实验第24天处死动物，分离肿瘤并称 重，计算抑瘤率(表1)。结果表明，与各对照组相比，PRDX5-shRNA具有显著抗肿瘤活性。 [0030] 表1 shRNA对裸鼠移植瘤SGC7901生长的抑制作用
[0032] #与生理盐水组相比P<0 · 01，#与shNC组相比P<0 · 05。
[0033]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种靶向抑制PRDX5基因表达的shRNA，其特征在于，包含5'端的正义框和3'端的反 义框，所述正义框的序列如SEQ ID NO: 1所示，并且所述反义框的序列为SEQ ID NO: 1所示 序列的互补序列，所述PRDX5的氨基酸序列如SEQ ID勵:2所示，所述?1^5的基因编码序列 如SEQ ID NO:3所示。2. 根据权利要求1所述的shRNA，其特征在于，所述正义框与所述反义框之间有3-10个 核苷酸的间隔，所述3-10个核苷酸至少部分不互补，以形成发卡环。3. 根据权利要求1所述的shRNA，其特征在于，所述反义框的3'末端附接了两个或更多 个尿苷。4. 根据权利要求1所述的shRNA，其特征在于，序列如SEQ ID N0:4所示。5. -种权利要求1-4中任一项所述的shRNA在制备抗癌药物中的应用。6. -种DNA载体，其特征在于，包含权利要求1-4中任一项所述的shRNA的DNA编码序列， 以及驱动所述DNA编码序列转录的启动子，所述DNA编码序列顺着所述启动子的转录方向有 效连接于所述启动子的下游。7. 根据权利要求6所述的DNA载体，其特征在于，所述启动子是在人的细胞中组成型表 达的启动子。8. -种权利要求6或7所述的DNA载体在制备抗癌药物中的应用。9. 一种抗癌药物组合物，其特征在于，包含权利要求1至4中任一项所述的shRNA和/或 权利要求6或7所述的DNA载体，以及药学可接受的载剂、赋形剂、稀释剂、佐剂中一种或多种 的组合。
【文档编号】A61K48/00GK105969772SQ201610388830
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】米佳, 姜文国, 田梗, 位晓丹, 李贺, 刘芳
【申请人】滨州医学院