一种叶酸受体靶向的敲除dnmt1基因的药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药领域，具体涉及一种叶酸受体靶向敲除DNMTl的药物组合物及其 制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 癌症是当今世界各国面临的一个主要的公共健康难题。在发达国家，癌症是人口 死亡的首要原因；而在发展中国家，癌症也是引起人口死亡的第二位原因。据最新癌症统计 学数据，全球癌症患者每年新发病例1266万，死亡病例756万。在发达国家如美国，每年癌 症新发病例约166万，因癌症死亡约58万，每4人中就有1人死于癌症。据《2012中国肿 瘤登记年报》，我国每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡约250万，全国每6分钟就有1 人被确证为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每7到8人中就有1人死于癌症。
[0003]虽然在过去的近20~30年间，传统治疗手段包括放射治疗、化学治疗和手术治 疗不断发展，但是新的治疗药物以及新技术的应用依旧未能改进癌症患者生存质量和存活 率。因此，新的治疗手段--基因治疗--的开发可能改变癌症的治疗现状。截止目前，肿 瘤基因治疗临床试验已开展近20年，仍在开放的临床试验829例，占整个基因治疗临床试 验的 66. 85% (829/1240)。
[0004] 表观遗传改变例如DNA甲基化涉及多种癌症的发生和进展。DNA甲基化反应是由 DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferase, DNMT)催化，在DNA的某个碱基上增加一个甲 基；DNA甲基化仅影响DNA链上鸟嘌呤前的胞嘧啶（CpG)。基因组中某些区域CpG比较聚 集(密度比较高)，这些区域常见于基因的启动子、第一个外显子和基因的3' -末端，这些区 域被称之为CpG岛。在正常细胞，大多数CpG岛完全无甲基化。研究发现，肿瘤细胞中的 抑癌基因启动子区域CpG岛过度甲基化，导致抑癌基因不表达，与肿瘤的发生、发展密切相 关。目前发现的DNMT主要包括DNMTl、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b，其中DNMTl在哺乳动物中 的含量最高，是调节DNA甲基化最重要的酶，主要参与维持性甲基化，可以在甲基化的DNA 模板指导下使新合成的DNA链发生甲基化。已经证明在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、宫颈 癌、白血病等多种人恶性肿瘤中DNMTl的表达增高，并且通过DNMTl介导的基因失活促进 肿瘤进展。因此，研究调控肿瘤DNMTl的策略已成为近年肿瘤治疗的热点和趋势。目前已 有靶向DNMTl的小分子抑制如5-氮杂胞苷和地西他滨应用于临床治疗骨髓增生异常综合 征。虽然这些小分子抑制剂在临床治疗中取得了一定疗效，但治疗过程中选择性差，毒性大 及仅对小部分患者有效等问题促使需要开发疗效更确切的基因治疗药物。
[0005]目前，基因编辑技术的迅速发展为基因治疗带来前所未有的机遇。其中Talen和 cas9技术因制备简单、效率高，已成为基因编辑的首选方案。相比RNA干扰的瞬时效应，基 因编辑技术可以稳定地导致基因失活，因而理论上该技术有广阔的应用前景。然而，将该技 术应用于临床治疗、尤其是肿瘤治疗还罕见报道。其中一个重要的瓶颈是缺乏高效、特异的 革巴向传输系统。
[0006]文献报道，多种上皮来源的肿瘤包括卵巢癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、宫颈 癌、脑癌、肺癌、头颈部癌以及结直肠癌等都有叶酸受体的高表达。利用可靶向肿瘤细胞表 面高表达的叶酸受体成分投递药物，可以实现肿瘤选择性的靶向给药，提高药物的抗肿瘤 效果。
[0007] 发明人拟构建一种叶酸受体靶向的敲除DNMTl基因的药物组合物，利用可靶向肿 瘤细胞表面高表达的叶酸受体成分，将敲除DNMTl基因的Talen或cas9载体投递到肿瘤部 位，提高DNMTl的敲除效率，使其具有较好的抗肿瘤效果。
【发明内容】
[0008] 本发明所解决的技术问题是提供一种叶酸受体靶向的敲除DNMTl基因的药物组 合物，目的在于提高DNMTl的敲除效率，从而提高抗肿瘤效果。
[0009] 该药物组合物含有叶酸受体靶向成分和敲除DNMTl基因表达的Talen和cas9载 体，可添加其他药学上可接受的成分，也可不添加其他成分。
[0010] 该药物组合物中的叶酸受体靶向成分包括但不限于叶酸受体的抗体、叶酸、叶酸 衍生物、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤衍生物。其中，叶酸受体的抗体包括但不限于单克隆抗体、多克 隆抗体和人源化抗体中的一种或多种，例如：Farletuzumab (M0RAb-003)或其他公开的叶 酸受体的抗体；叶酸衍生物包括但不限于四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5, 10-亚甲基四氢叶 酸、5-甲酰四氢叶酸、10-甲酰四氢叶酸、5, 10-二脱氮四氢叶酸中的一种或多种。
[0011] 该药物组合物中的敲除DNMTl基因的基本成分是Talen或cas9,其靶向的DNA序 列是针对DNMTl基因的DNA碱基序列而设计。Talen或cas9可以不用载体，直接与叶酸 受体靶向成分形成组合物；也可选择性构建在包括但不限于质粒、病毒、噬菌体、脂质体、胶 束、纳米粒在内的一种载体或几种载体中。其中，病毒包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、慢 病毒、逆转录病毒、溶瘤病毒中一种或多种。
[0012] 该药物组合物中叶酸受体靶向成分与敲除DNMTl的Talen或cas9的组装方式包 括但不限于以下方式中的一种或多种：叶酸受体靶向成分直接与Talen或cas9偶联，或叶 酸受体靶向成分修饰在Talen或cas9的表面。
[0013] 具体地，利用Talen和cas9在线序列设计软件，例如ZIFIT PARTNERS，设计敲除 DNMTl基因的靶序列，再与GeneBank序列比对，设计序列不能与人体其他基因存在高度同 源性。依据此设计的序列，构建Talen和cas9序列。利用上述方法，已验证了 2个Talen 序列和 4 个 cas9 序列，编号为 Talenl、Talen2 和 cas9_l、cas9_2、cas9_3、cas9_4。
[0014] Talenl 序列为： TalenlL :CCACAGTGTTCACA, TalenlR :GACCAGCTTCAGCA。
[0015] Talen2 序列为： Talen2L :ACCACGCAGACATCAACCT,Talen2R: CCACCACGGCCTCCT。
[0016] cas9-l 序列为：GGGCCATCGAGATGTGGGACCCTGCGGCCC; cas9-2 序列为：GGAGATGCTGTGCGGCGGGCCGCCCTGCCA ; cas9-3 序列为：GGTGGAGCAGGTGGAGAGTTATGACGAGGC ; cas9-4 序列为：GGGCAGCTTGATCTCTATCTCTGGCTCGCT。
[0017] 敲除DNMTl基因的序列，可以是通过上述原则设计的其他任何序列，并不限于以 上所列的具体序列。
[0018] Talen和cas9载体可直接与叶酸受体祀向成分偶联形成组合物。具体地，Talen 和cas9载体的羟基可与叶酸受体靶向成分包括叶酸受体的抗体、叶酸及其衍生物、甲氨蝶 呤及其衍生物的羧基直接偶联，形成酯化复合物。或者，Talen和cas9载体还可通过一定 的间隔基与叶酸受体靶向成分连接；具体地，叶酸受体靶向成分可先与生物素偶联，再加入 链霉亲和素和Talen和cas9载体，即形成Talen和cas9载体与叶酸受体祀向成分的组合 物。Talen和cas9载体与叶酸受体靶向成分直接偶联形成组合物的方法，可包括多种其他 任何能让二者相连的方法，并不限于以上所列方法。
[0019] 敲除DNMTl基因表达的Talen和cas9可以构建于质粒、病毒、噬菌体在内的一种 载体。其中，病毒包括但不限于腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、溶瘤病毒中一种或多种。具体 构建方法为常规方法，具体参照分子克隆实验室指南(第三版，科学出版社，2002)中所述方 法，或者按照所用试剂盒的生产厂商所建议的条件。具体的质粒、病毒、噬菌体表达载体可 以是商品化的载体也可以是构建的新型载体。
[0020] 敲除DNMTl基因的Talen和cas9载体也可以装载入脂质体、胶束、纳米粒在内的 一种载