体或多种载体。具体装载方式为：脂质体、胶束或纳米粒静电吸附、物理包裹中的一 种或多种直接转载Talen和cas9载体。具体地，脂质体选自阳离子脂质体、中性脂质体、 阴性脂质体；胶束载体材料可选用商品化的辅料如泊洛沙姆、磷脂等，或者文献已经报道 的载体如PEG与聚酯类的嵌段共聚物（包括：PEG-PCL、PEG-PLA、PEG-PLGA、PEG-PCL-PEG、 PEG-PLA-PEG、PEG-PLGA-PEG、PCL-PEG-PCL、PLA-PEG-PLA、PLGA- PEG-PLGA)，或者新设计 合成的聚合物载体，或新设计的载体以及内源性成分的衍生物中的一种或几种；纳米粒载 体材料可选用商品化的辅料如PLGA、PLA、壳聚糖、透明质酸、PEI等，或者文献已经报道的 载体如PLGA、PLA、壳聚糖、透明质酸或PEI的衍生物，或者PEG与聚酯类的嵌段共聚物(包 括：PEG-PCL、PEG-PLA、PEG-PLGA、PEG-PCL-PEG、PEG-PLA-PEG、PEG-PLGA-PEG、PCL-PEG-PCL、 PLA-PEG-PLA、PLGA- PEG-PLGA)，或者新设计合成的聚合物载体，或新设计的载体以及内源 性成分的衍生物中的一种或几种。
[0021] 叶酸受体靶向的敲除DNMTl基因的Talen或cas9载体药物组合物，其叶酸受体 靶向成分与敲除DNMTl基因的Talen和cas9载体的组装方式除叶酸受体靶向成分直接与 Talen和cas9载体偶联外，还包含叶酸受体祀向成分修饰在Talen和cas9载体表面的方 式。
[0022] 叶酸受体祀向成分直接修饰在Talen和cas9载体表面。具体地，Talen和cas9载 体表面的氨基可与叶酸受体靶向成分包括叶酸受体的抗体、叶酸及其衍生物、甲氨蝶呤及 其衍生物的羧基直接偶联，形成酰胺化复合物。或者，质粒还可通过一定的间隔基与叶酸受 体靶向成分连接，间隔基包括聚乙二醇链(分子量200~5000Da的聚乙二醇均可)、氨基己 酸等。质粒与叶酸受体靶向成分直接偶联形成组合物的方法，可包括多种其他任何能让二 者相连的方法，并不限于以上所列方法。
[0023] 叶酸受体靶向成分直接修饰在病毒、噬菌体、细菌、真菌表面。具体地，病毒、噬菌 体、细菌、真菌表面蛋白的氨基可与叶酸受体靶向成分包括叶酸受体的抗体、叶酸及其衍 生物、甲氨蝶呤及其衍生物的羧基直接偶联，形成酰胺化复合物。或者，病毒、噬菌体、细 菌、真菌还可通过一定的间隔基与叶酸受体靶向成分连接，间隔基包括聚乙二醇链(分子量 200~5000Da的聚乙二醇均可)、氨基己酸等。病毒、噬菌体、细菌、真菌与叶酸受体靶向成 分直接偶联形成组合物的方法，可包括多种其他任何能让二者相连的方法，并不限于以上 所列方法。
[0024] 叶酸受体靶向成分直接修饰在脂质体、胶束、纳米粒表面。具体地，脂质体、胶束、 纳米粒表面的氨基可与叶酸受体靶向成分包括叶酸受体的抗体、叶酸及其衍生物、甲氨蝶 呤及其衍生物的羧基直接偶联，形成酰胺化复合物。或者，脂质体、胶束、纳米粒还可通过一 定的间隔基与叶酸受体靶向成分连接，间隔基包括聚乙二醇链(分子量200~5000Da的聚 乙二醇均可)、氨基己酸等。脂质体、胶束、纳米粒与叶酸受体靶向成分直接偶联形成组合物 的方法，可包括多种其他任何能让二者相连的方法，并不限于以上所列方法。
[0025] 本发明提供的叶酸受体靶向的敲除DNMTl基因的Talen或cas9载体的药物组合 物，可以特异性与肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体结合，并通过叶酸受体介导的高效内吞 作用提高DNMTl的敲除效率，从而提高抗肿瘤效果。
[0026] 叶酸受体靶向的敲除DNMTl基因的Talen或cas9载体的脂质体包含磷脂和胆固 醇两类脂质材料，也可添加其他任何药学上可接受的成分。磷脂种类很多，可采用制剂领 域常用于制备脂质体的磷脂类型；胆固醇也可采用制剂领域常用于制备脂质体的胆固醇类 型。具体地，制备叶酸受体靶向的敲除DNMTl基因的Talen或cas9载体的脂质体时，采用 的脂质为中性脂质，负电荷脂质或正电荷脂质材料，包括：磷脂、大豆磷脂、卵磷脂、脑磷脂、 鞘磷脂、二甲基双十八烷基溴化铵（DDAB)、sn-甘油1，2 -二油酰-3 -磷酸胆碱（DOPC)、 1，2_二油酰基-3-三甲基铵丙烷(氯化物盐)(D0TAP)、1，2 -二十八烷基-SN-甘油-3 -磷酸乙醇胺（DSPE)、胆固醇、[N- (N'，N'_二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰基]胆甾醇盐酸 盐（DC-胆固醇)。
[0027] 其中，磷脂(包括磷脂衍生物)与胆固醇（包括胆固醇衍生物)摩尔比为0.5 : 1~ 10 : 1，PEG修饰脂质占总脂质摩尔数的0.01~15%，叶酸占总脂质摩尔数的0.01~2. 5%， PEG分子量为200~5000。
[0028]
【具体实施方式】
[0029] 以下通过对本发明【具体实施方式】的描述说明但不限制本发明。
[0030] 实施例1敲除DNMTl的cas9序列设计 矛Il用在线设计软件（http://zifit. partners. org/zifit/csqua;re9nuclease. aspx)设计 敲除DNMTl的cas9作用序列，再与GeneBank序列比较，筛选出不与人体其他任何DNA存 在高度同源性的序列，如下： GGGCCATCGAGATGTGGGACCCTGCGGCCC ； GGAGATGCTGTGCGGCGGGCCGCCCTGCCA ； GGTGGAGCAGGTGGAGAGTTATGACGAGGC ； GGGCAGCTTGATCTCTATCTCTGGCTCGCT。
[0031] 实施例2敲除DNMTl的talen序列设计 利用在线设计软件（http://zifit. partners. org/zifit/ChoiceMenu. aspx)设计敲除 DNMTl的Talen作用序列，再与GeneBank序列比较，筛选出不与人体其他任何DNA存在高 度同源性的序列，如下： Talenl序列为： TalenlL :CCACAGTGTTCACA, TalenlR :GACCAGCTTCAGCA。
[0032] Talen2 序列为： Talen2L :ACCACGCAGACATCAACCT,Talen2R: CCACCACGGCCTCCT。
[0033] 实施例3 cas9_DNMTl表达质粒载体构建 首先设计并合成编码对应靶序列的的DNA模板上下游引物；分别以30 y L退火缓冲 液，溶解引物上下游片段（I0D)。各取2 UL上述溶液+16 UL退火缓冲液混匀，加热至 94°C后自然退火冷却至室温。取I y L退火产物+99ii L水做100倍稀释。将cas9质粒 表达载体以Bbsl限制性内切酶进行酶切，酶切产物以1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收质粒大片 段。DNMTl退火片段与cas9质粒线性化连接。连接产物转化感受态DH5a大肠杆菌，涂布 于含氨节霉素抗性(终浓度为50 ii g/mL)的LB琼脂糖培养基平板上，37°C恒温培养箱培养 过夜。进行小规模质粒抽提，测序鉴定。经测序结果分析阳性克隆质粒经Qiagen公司大抽 试齐Il盒（PlasmidextractionandpurificationEndoFreePlasmidGigaKits)大规模制 备，即得 cas9-DNMTl。
[0034] 实施例4包装有cas9_DNMTl的质粒直接与叶酸受体靶向成分偶联形成组合物 将0. 05微摩尔NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)和0. 1微摩尔EDC (1-乙基-3 - (3-二甲基 氨基丙基）-碳化二亚胺)加入1ml叶酸单克隆抗体Farletuzumab溶液（5mg/ml )，室温搅拌 15分钟；再加入1ml cas9-DNMTl溶液（5mg/ml)中4 C孵育过夜，再置于透析袋中，用IOmM 憐酸盐缓冲液（pH 7. 4)在4 C透析12h，即得Farletuzumab-cas9_DNMTl复合物。
[0035] 实施例5~10以a -羧基氨基聚乙二醇为间隔基制备叶酸修饰脂质 具体投料如下：
具体操作为：取a-羧基氨基聚乙二醇(氨基末端保护）0.5mmol，脂质材料(胆固 醇或磷脂)〇