靶向olfm4基因的干扰rna、慢病毒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种靶向OLFM4基因的干扰RNA及慢病毒载体，用于制备预防、治疗胃癌肿瘤向腹腔或/和肝转移的药物中的用途。本发明利用所述干扰RNA不仅具有抑制胃癌细胞的体外迁移与侵袭能力，还能具有抑制胃癌细胞的肝脏转移能力；使得减弱OLFM4表达具有潜在治疗晚期胃癌恶性进展的有效方式。并进一步明确NF-kB信号为OLFM4表达的上游调控转录因子，还具有反馈调控NF-kB信号功能。
【专利说明】靶向0LFM4基因的干扰RNA、慢病毒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，主要涉及利用RNAi沉默0LFM4基因用于制备预防、治疗胃癌肿瘤向腹腔或/和肝转移的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]胃癌是我国第二大常见恶性肿瘤，亦是癌症致死的第二大原因。尽管目前胃癌综合治疗措施不断发展完善，使得当前的治疗仍不能获得满意效果，由于多数胃癌患者在首诊时已属中晚期，进展期胃癌占住院病例90 %以上，术后5年生存率长期徘徊在30-50 %。目前研究发现多数恶性肿瘤治疗效果不佳的主要原因在于转移与复发。胃癌晚期，恶性癌细胞经侵袭发生血行播散经门静脉转移至其他器官如肝脏，导致多种脏器功能衰竭，因此胃癌侵袭与肝转移是晚期胃癌患者死亡的最主要原因之一。由此，对于胃癌的抗转移治疗现状，寻找一个治疗性靶点抑制胃癌的浸润和肝转移，将有助于改善胃癌治疗，在提高晚期胃癌患者生存率具有重要意义。
[0003]从医学角度而言，肿瘤细胞无限制增殖是良性与恶性肿瘤的共同特征；而肿瘤的恶性侵袭与转移则是区分良性肿瘤与恶性肿瘤的主要特征之一。恶性肿瘤最重要的生物学特点在于恶性肿瘤不仅可在原发部位浸润生长、累及组织；而且还可通过多种途径扩散转移到身体其他部位。尽管侵袭和转移均为恶性肿瘤的生长特性，但二者是不同病理过程，浸润是转移的前奏，但并不等于一定发生转移，然而转移必定包含侵袭的过程，它们共同构成恶性肿瘤的播散。许多治疗靶点对肿瘤细胞的增殖能力调控并不等同与其同时具有调控恶性侵袭与转移能力。 目前发现，多种恶性肿瘤高表达蛋白如Cyclin D1，具有调控细胞周期与细胞增殖功能，但并不具有控制恶性侵袭与转移功能。
[0004]0LFM4，又名GW112、hGC_l、h01fD，是2002年新发现的一种由粒细胞集落刺激因子GM-CSF刺激产生的具有嗅觉介导素结构域(olfactomedin domain)蛋白家族成员分子。它最初被克隆于人的原始粒细胞，位于人类13号染色体13ql4.3，编码510个氨基酸，其蛋白产物为olfactomedin4的前体,属于嗅觉介导素olfactomedin相关蛋白家族。此类蛋白多表达于神经系统，涉及神经系统的发育。
[0005]0LFM4蛋白是一种分泌性糖蛋白，包括N-连接的碳水化合链和二硫化物多聚体，它与细胞表面的多种凝集素结合，如普通的凝集素1、刀豆蛋白凝集素A、麦胚凝集素。GWl 12蛋白的保守半胱氨酸对蛋白寡聚化或分泌非常重要，其中半胱氨酸83，85，246和437是蛋白二聚体形成所必需的，半胱氨酸226是多聚体形成的关键。0LFM4蛋白和钙粘蛋白的相互作用，依赖于0LFM4蛋白C端的嗅觉介导素区域。0LFM4蛋白可粘附在细胞表面，增强NIH3T3和293T/17细胞的扩散和粘附作用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种靶向0LFM4基因的干扰RNA在用于制备预防、诊断、治疗胃癌肿瘤向腹腔或/和肝转移的药物中的用途。[0007]本发明的目的是通过以下措施实现的:
[0008]一种靶向0LFM4基因的干扰RNA，其核苷酸序列如下
[0009]正义链:
[0010]5' -CCGGAACGCTTGGAATTCACAGCTC [CTCGAG^GAGCTGTGAATTCCAAGCGTTTTTTTG-3'；
[0011]反义链:
[0012]5, -AATTCAAAA AAACGCTTGGAATTCACAGCTC:jCTCGAG[ GAGCTGTGAATTCCAAGCGTT-3'。
[0013]体外合成所述述可转录出特异靶向0LFM4基因干扰性RNA(RNAi)的DNA序列，0LFM4 基因 RNAi 靶点 DNA 序列为:AACGCTTGGAATTCACAGCTC。干扰 RNA，下划线部分[CTCGAG ,
所示为0LFM4基因RNAi靶点DNA序列，构成转录后RNA的“Stem(茎)”结构部分；框中所示部分为6个碱基的loop环结构，具有连接转录后RNA的“茎”结构功能。
[0014]本发明进一步提供了包含上述干扰性RNA的Lentivirus慢病毒，所述慢病毒载体的结构如图1所示。上述RNA干扰序列经退火体外合成为双链DNA，并通过两段酶切位点连接入RNAi干扰载体，转染或包装入病毒并感染细胞后，在细胞内能转录出特异抑制0LFM4基因信使RNA (mRNA)转录的RNAi片段，有效的降低0LFM4基因mRNA转录水平进而对0LFM4蛋白表达进行抑制。
[0015]上述靶向0LFM4基因的RNAi慢病毒载体，制备方法包括以下步骤:
[0016](I)体外合成上述DNA序列；
[0017](2)退火配对产生DNA双链，通过两端所含的酶切位点AgeI与EcoRI连入酶切后的GVl 15载体；
[0018](3)将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，抽提DNA重组质粒；DNA测序验证阳性重组克隆；
[0019](4) Lentivirus 病毒包装:
[0020]①转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2X IO7细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37°C、5% CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70%~80%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
[0021]②转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。
[0022]③向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20 μ g，pHelperl.0载体15 μ g，pHelper2.0载体10 μ g)，与相应体积的Opt1-MEM培养基混合均匀，调整总体积为2.5ml,在室温下温育5分钟。
[0023]④将Lipofectamine2000 试剂轻柔摇匀，吸取 100 μ I Lipofectamine2000 试剂在另一管中与2.4ml Opt1-MEM混合，在室温下温育5分钟。
[0024]⑤把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。
[0025]⑥混合后,在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物。
[0026]⑦将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37°C,5% C02细胞培养箱中培养。[0027]⑧培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
[0028]⑨每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基25ml，于37°C、5% CO2培养箱内继续培养48小时。
[0029](5)病毒的收获及浓缩
[0030]①收集转染后48小时(转染即可为O小时计起)的293T细胞上清液。
[0031]②于4°C，4000g离心10min，除去细胞碎片。
[0032]③以0.45 μ m滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。
[0033]④把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19ml)，盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。
[0034]⑤组合好后，做好平衡，放在转头上。
[0035]⑥在4000Xg离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。
[0036]⑦离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。
[0037]⑧将过滤杯倒扣在样品收集杯上。
[0038]⑨离心力不超过 lOOOg，时间为2分钟。过高转速会导致样品损失。把过滤杯从样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。
[0039]⑩将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，_80°C长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。
[0040](6) Lentivirus 滴度测定
[0041]①测定前一天，为测定滴度所需的细胞(293T细胞:贴壁生长)铺板，96孔板，每个孔加4X IO4个细胞，体积为IOOyL ；
[0042]②根据病毒的预期滴度，准备7-10个无菌的Ep管，每管加入90 μ I的无血清培养基。
[0043]③取待测定的病毒原液10 μ I加入到第一个管中，混匀后，取10 μ I加入到第二个
管中。继续相同的操作直到最后一管。
[0044]④选取所需的细胞孔，吸去90 μ I培养基，丢弃；加入90 μ I稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。
[0045]⑤24小时后，加入完全培养基100 μ I。小心操作，不要吹起细胞。
[0046]⑥4天后，观察荧光表达情冴观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。
[0047]⑦滴度计算:根据荧光图片中GFP表达情况。
[0048]上述干扰性RNA或慢病毒在制备用于预防、诊断、治疗胃癌肿瘤向腹腔或/和肝转移的药物中的用途。
[0049]上述干扰性RNA或慢病毒在制备用于抑制NF-KB信号途径传导的药物中的用途。
[0050]有益效果
[0051]1.本发明提供了 0LFM4基因新的用途，其利用RNAi沉默0LFM4表达抑制了胃癌细胞向肝脏和腹腔的转移，确立了转移防治靶点，是一种有效的干预策略提高胃癌的疗效。
[0052]2.本发明设计并构建了特异性靶向0LFM4基因的干扰RNA及其载体，能稳定转染胃癌细胞株，从而抑制0LFM4蛋白表达，为抑制胃癌的转移从而为胃癌转移治疗的干预提供有效靶点。
[0053] 3.本发明证明利用慢病毒介导的0LFM4_siRNA不仅具有抑制胃癌细胞的体外迁移与侵袭能力，还能具有抑制胃癌细胞的肝脏转移能力；使得减弱0LFM4表达具有潜在治疗晚期胃癌恶性进展的有效方式。并进一步明确NF-kB信号为0LFM4表达的上游调控转录因子，还具有反馈调控NF-kB信号功能。本发明在慢病毒介导的0LFM4-siRNA在胃癌抗转移治疗的关键问题上，具有如下创新
[0054](1)采用慢病毒介导的0LFM4-siRNA方式，可作为体内外siRNA传递有效方式；而其表达的siRNA能特异性抑制0LFM4基因表达，达到稳定抑制胃癌细胞内0LFM4基因表达的效果。
[0055](2)慢病毒介导0LFM4-siRNA对0LFM4表达的稳定抑制，具有减低胃癌细胞体外迁移与侵袭能力；尤其显著抑制了体内胃癌细胞的肝脏转移能力。
[0056](3) 0LFM4基因的表达下调能够反馈抑制NF-KB信号途径，利用抑制0LFM4通过反馈抑制NF-KB信号，抑制胃癌细胞的肝脏转移能力。
【专利附图】
【附图说明】
[0057]图1靶向0LFM4基因的RNAi慢病毒载体结构图
[0058]图2实施例1中构建的干扰RNA慢病毒的滴度测定荧光照片(样品说明:第一个Ep管中加入IOul病毒原液,记为1E+1 μ I ;第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10,记为1Ε+0μ I ;第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释,所得病毒原液为第二个Ep中的1/10,记为IE-1 μ I)
[0059]图3实施例1中0LFM4_siRNA序列测序图谱
[0060]图4实施例1中NC-siRNA阴性对照(NC-GFP-LV)序列测序图谱[0061 ] 图5实施例1中MKN-45细胞感染慢病毒48h后荧光效果
[0062]图6实施例1中经流式细胞仪分选后测得GFP+荧光率
[0063]图7实施例1中经Real-time PCR检测细胞中0LFM4mRNA表达
[0064]图8实施例1中0LFM4敲减后Western blot检测0LFM4蛋白表达
[0065]图9实施例2中Transwell法测定迁移能力，左图为三次实验中典型图片(200X)，右图为显微镜下10个随机视野的平均迁移细胞数
[0066]图10实施例2中Transwell法测定MKN-45细胞侵袭能力，左图为三次实验中典型图片(200X)，右图为显微镜下10个随机视野的平均侵袭细胞数
[0067]图11实施例2中经尾静脉注射和腹腔注射MKN-45后肝脏表面和肠系膜转移肿瘤结节数量比较，上图为肉眼下转移肿瘤典型图片，下图为肝脏表面及肠系膜转移肿瘤结节平均数
[0068]图12实施例2中HE染色检测转移肿瘤组织
[0069]图13实施例3中比较0LFM4敲减后总蛋白中NF- κ B相关蛋白表达水平
[0070]图14实施例3中比较0LFM4敲减后胞浆蛋白中0LFM4的表达及胞浆胞核蛋白中NF- κ B通路相关蛋白表达水平
[0071 ] 图15实施例3中0LFM4敲低后胞核蛋白与NF- κ B DNA的结合活性明显被抑制
[0072]图16实施例3中人肿瘤转移Real-time PCR芯片基因检测的扩增曲线㈧和部分融解曲线(B)
【具体实施方式】
[0073]下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
[0074]实施例1慢病毒载体的构建及稳定感染细胞株的建立
[0075]I 材料
[0076]1.1细胞株
[0077]人胃癌细胞株MKN-45购自生科院上海细胞所。
[0078]1.2慢病毒构建RNA序列
[0079]0LFM4-RNAi 干扰靶点序列:AACGCTTGGAATTCACAGCTC
[0080]NC-RNA 序列:TTCTCCGAACGTGTCACGT
[0081]1.3引物设计
[0082]0LFM4扩增弓丨物序列: [0083]0LFM4-F:5/ -ACAGAGTGGAACGCTTGGAA-3'
[0084]0LFM4-R: 5' -CCTTCTCCATGATGTCAATTCG-3'
[0085]内参β -actin扩增引物序列:
[0086]β -actin-F:5/ -CCAACCGCGAGAAGATGA-3'
[0087]β -actin-R:5/ -CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3'
[0088]1.4主要试剂及耗材
[0089]
【权利要求】
1.一种祀向0LFM4基因的干扰RNA,其核苷酸序列如下: 正义链:5,
-CCGGAACGCTTGGAATTCACAGCTCCTCGAGGAGCTGTGAATTCCAAGCGTTTTTTTG-3 '，即 SEQ IDN0.1 ； 反义链办’
-AATTCAAAAAAACGCTTGGAATTCACAGCTCCTCGAGGAGCTGTGAATTCCAAGCGTT-3'，即 SEQ IDN0.2。
2.包含权利要求1所述的靶向0LFM4基因的干扰RNA的Lentivirus慢病毒，所述慢病毒载体的结构如图1所示。
3.如权利要求2所述的Lentivirus慢病毒,制备方法包括以下步骤: (1)体外合成上述DNA序列； (2)退火配对产生DNA双链，通过两端所含的酶切位点AgeI与EcoRI连入酶切后的GVl 15载体； (3)将连接产物转 入制备好的细菌感受态细胞，抽提DNA重组质粒；DNA测序验证阳性重组克隆； (4)Lentivirus 病毒包装: ①转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2X IO7细胞/20 ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37°C、5% CO2培养箱内培养，24 h后待细胞密度达70%~80%用于转染； ②转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基； ③向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μ g , pHelper 1.0载体15 μ g，pHelper 2.0载体10 μ g)，与相应体积的Opt1-MEM培养基混合均匀，调整总体积为2.5 ml,在室温下温育5分钟； ④将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，吸取100μ I Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4ml Opt1-MEM混合，在室温下温育5分钟； ⑤把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合,轻轻地颠倒混匀，在5分钟之内混合； ⑥混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物； ⑦将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37°C，5%C02细胞培养箱中培养； ⑧培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去； ⑨每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基251111，于371:、5%0)2培养箱内继续培养48小时； (5)病毒的收获及浓缩 ①收集转染后48小时的293T细胞上清液； ②4°C，4000g离心10min，除去细胞碎片； ③以0.45 μ m滤器过滤上清液于40 ml超速离心管中；④把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19ml)，盖上盖子；将过滤杯插到滤过液收集管中； ⑤组合好后，做好平衡，放在转头上； ⑥在4000Xg离心10-15分钟，至需要的病毒浓缩体积； ⑦离心结束后，芰出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开； ⑧将过滤杯倒扣在样品收集杯上； ⑨离心力不超过1000g,时间为2分钟；把过滤杯从样品收集杯上移开；样品收集杯中的即为病毒浓缩液； ⑩将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，_80°C长期保存；取其中一支进行病毒生物学滴度测定； (6) Lentivirus 滴度测定 ①测定前一天，293T细胞铺96孔板，贴壁生长，每个孔加4XIO4个细胞，体积为100μ L ；②根据病毒的预期滴度，准备疒10个无菌的Ep管，每管加入90μ I的无血清培养基； ③取待测定的病毒原液10μ I加入到第一个管中，混匀后,取10 μ I加入到第二个管中，继续相同的操作直到最后一管； ④选取所需的细胞孔，吸去90μ I培养基，丢弃；加入90 μ I稀释好的病毒溶液；放入培养箱培养； ⑤24小时后，加入完全培养基100μl ; ⑥4天后，观察荧光表达情冴观察荧光表达情况；荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少； ⑦滴度计算:根据荧光图片中GFP表达情况。
4.如权利要求1所述的干扰性RNA或如权利要求2所述的慢病毒在制备用于预防、诊断、治疗胃癌肿瘤向腹腔或/和肝转移的药物中的用途。
5.如权利要求1所述的干扰性RNA或如权利要求2所述的慢病毒在制备用于抑制NF-KB信号途径传导的药物中的用途。
【文档编号】A61P35/00GK103981186SQ201410186285
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月5日 优先权日:2014年5月5日
【发明者】黄轶, 宋利华, 李阳, 包黎明 申请人:重庆医科大学附属儿童医院